人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

          作者：吴元明，陈苏民，陈南春，纪宗玲，刘惠萍，张俊杰

【关键词】  人Era基因

　　关键词: 人Era基因;基因表达;蛋白纯化

　　摘 要:目的  在大肠杆菌中对人的era基因（简称hera）进行表达、纯化. 方法  PCR扩增hera基因，测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C，重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌，用IPTG进行诱导表达.然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化. 结果  克隆了hera基因，测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因，表达量占细菌总蛋白的59.6%.融合蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白，其纯度达到了98.0%. 结论  利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因.并对融合蛋白进行了初步纯化.
    
　　　Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation
    
　　Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRSET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）and　induced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be correct.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed in E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CONCLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli by using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily.
    
　　0 引言
    
　　era基因是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseIII的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coli Ras-like（era）基因［1］ .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕虫、小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成员.它由两个结构域组成:N端是一个典型的GTPase结构域;C端结构域为Era所特有，其中含有一个KH结构域［2］ .在大肠杆菌中era基因和rnc基因同属于rnc操纵元，rnc基因和era基因的表达共同受RNaseIII的负调控［3］ .era是大肠杆菌中可以正常表达的基因，但表达水平极低.遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁殖所必需的重要基因 ［4］ .高表达的细菌Era蛋白有GTP结合及GTPase活性［5］ .最近发现细菌Era蛋白可以特异地与16S-rRNA结合［6］ .
   
　　本室陈苏民教授通过机寻索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌era同源的EST序列，并且相继克隆了人及小鼠全长的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全长约2.2kb，含长度为1038bp的开放读框，编码346氨基酸的蛋白质［7］ .人Era（hEra）与大肠杆菌Era（eEra）蛋白全序列比较，有31.0%相同、53.0%相似.同样，hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成［8］ .新近克隆的人及小鼠era基因为整个era基因家族的功能研究提供了重要的资料.本研究目的是将hera基因在大肠杆菌中进行高表达、纯化.这为进一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基础.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料 

　　大肠杆菌BL21（DE3）菌种购自Promega公司.pUC19质粒均为本教研室保存;表达质粒pRSET-C为Invitrogen公司产品.pBS-hera为陈苏民教授提供.各种限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为Gibco公司产品.DNA marker和蛋白marker为Takara公司产品.柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.NucleoTrap Gel Extraction试剂盒购于CLONTECH公司.Ni-NTA spin kit为QIAGEN公司产品.

　　1.2 方法
   
　　1.2.1 PCR反应及产物的鉴定 

　　PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向:5'-AA-CTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC.PCR反应以pBS-hera为模板在PE公司9600反应仪上进行.PCR反应条件为:96℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环.纯化的PCR产物用BamHI和PstI双酶切定向克隆入pUC19质粒，转化E.coli JM109，进行蓝白筛选，并经酶切鉴定筛选出含插入片段的阳性克隆.重组的pUC19质粒经提取纯化后，以此作为测序模板，在PE公司310型测序仪上进行核苷酸序列分析.
    
　　1.2.2 重组表达载体构建 

　　从重组的pUC19质粒上用BamHI和PstI切下目的片段，再用BamHI和PstI双酶切pRSET-C载体.目的片段与载体片段均用NucleoTrap Gel Extraction试剂盒从琼脂糖凝胶内回收.然后进行DNA的连接，将DNA连接液转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用氨苄抗性进行筛选，经酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆.
    
　　1.2.3 蛋白诱导表达 

　　挑取pRSETC-hera重组表达菌株，接种于5mL含Amp的2xYT培养基（胰蛋白胨16g L-1 ，酵母提取物10g L-1 ，NaCl5g L-1 ），37℃培养过夜，次日按4.0%转接于含Amp的2xYT培养基，37℃振荡培养3h，加入IPTG至终浓度1mmol L-1 诱导表达，37℃振荡培养2～7h.取菌体，做120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）.
   
　　1.2.4 SDS-PAGE 4℃9000g离心5min收集菌体，用含3mL L -1 巯基乙醇加样缓冲液处理（100℃， 10min），12000g离心10min，采用Laemmli不连续PAGE，150g L-1 分离胶，考马斯亮蓝R-250染色.

　　1.2.5 蛋白质的纯化 

　　离心收集100mL诱导菌液的菌体，按每克湿菌体10mL加入超声缓冲液（0.05mol L-1 NaH2 PO4 ，0.3mol L-1 NaCl）悬浮，-20℃冻融2次，再加入溶菌酶至1g L-1 ，室温放置30min，然后超声裂解（150W，每次1min，共5次），4℃下12000g离心20min.再加入超声缓冲液10mL悬浮包涵体，4℃下12000g离心20min，收集包涵体沉淀.用5mL缓冲液B（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris Cl，pH8.0）悬浮包涵体，Vortex，室温放置2h，4℃下12000g离心15min，取上清，4℃下12000g再离心15min，留上清上Ni-NTA亲和色谱柱.先用缓冲液B预平衡Ni-NTA柱，上样，用缓冲液C（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH6.3）洗涤，接着用缓冲液D（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH5.9）洗涤，再用缓冲液D1（缓冲液C，250mmol L-1 咪唑）洗脱，用缓冲液E（8mol L-1 尿素，100mmol L－1 NaH 2 PO
4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH4.5）灌洗.在280nm监测下，收集每个吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE.

    
　　2 结果
    
　　2.1 hera基因的扩增 

　　以pBS-hera质粒为模板，经PCR扩增获得hera基因片段，扩增产物经1.0%AGE，与编码hEra全长的cDNA（1038bp）大小相符（Fig1）.将全长hera基因片段克隆入pUC19质粒，重组质粒转化DH5α感受态细胞，从培养板上随机挑选白色克隆，从中提取质粒，用BamHI和PstI双酶切鉴定，含有插入片段的重组质粒命名为pUC19-hera.酶切鉴定结果见Fig2.提取重组质粒pUC19-hera，以pUC19通用测序引物进行核苷酸序列测定.测序结果表明，所扩增的hera基因与已知序列完全相符.

　　2.2 pRSETC┐hera表达质粒的构建和诱导表达 

　　将hera-cDNA基因全长从pUC19-hera亚克隆到表达载体pRSET-C中，经酶切鉴定，将重组表达质粒命名为pRSETC-hera.酶切鉴定结果见Fig3.将pRSETC-hera质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，在2xYT培养基中生长，转接后用IPTG诱导4h，由120g L-1 SDS-PAGE结果可见:与未诱导的对照菌相比诱导菌在Mr 42×103 处有明显的新蛋白表达带出现，大小和预期的6His-hEra融合蛋白相符（Fig4），激光薄层扫描结果表明此表达条带占菌体总蛋白的59.6%.表达产物主要以包涵体的形式存在.

　　2.3 6His┐hEra融合蛋白的纯化 

　　收集100mL诱导菌液的菌体，经裂菌、离心、洗涤、再离心后获得包 涵体沉淀.包涵体被变性溶解后上Ni-NTA柱，用缓冲液C，D洗涤，用含咪唑的缓冲液D1洗脱，再用缓冲液E灌洗.在280nm监测下，观察蛋白的流出情况.收集每个吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE（Fig5）.激光薄层扫描结果表明，用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白的纯度达到了98.0%.
   
　　3 讨论
    
　　我们利用基因工程的手段在pRSET-C载体内高表达了hEra蛋白.pRSET-C是一个受PT7 强启动子驱动下的融合表达载体，因而易于在原核进行的目的基因高表达.另外，在目的基因的5'端融合了6个组氨酸的纯化标签，可以用金属螯合亲和层析来分离纯化表达的融合蛋白.组氨酸与金属离子的结合与蛋白质的空间结构无关，因此表达的融合蛋白就可以在变性条件下得到纯化，然后复性，这就避免了复性后的蛋白质由于纯化条件的改变而丢失.
   
　　不同的培养条件对外源基因的表达效率也有一定的影响.含pRSETC-hera质粒的BL21（DE3）菌在LB培养基中IPTG诱导6His-hEra融合蛋白表达时，表达产物占菌体总蛋白的30.0%;当改用2xYT培养基时，外源基因的表达效率明显提高，表达产物达菌体总蛋白的59.6%.在不同培养基培养条件下，表达产物均以包涵体形式存在.我们先对包涵体进行了分离、洗涤和纯化.然后用金属亲和层析的方法对其进行了进一步的纯化、复性.当pH≥6.3时，融合了6个组氨酸的蛋白质能和螯合了Ni2+ 的金属亲和层析柱相结合;而当pH=5.9或在咪唑存在的情况下，融合蛋白不再与Ni2+ 结合而被洗脱下来.我们在实验中发现，用含咪唑的洗脱液进行洗脱的方法要好于通过降低pH值进行洗脱的方法.首先降低pH值不能将融合蛋白洗脱干净，我们用pH=5.9的洗脱液进行洗脱时（Fig5），就不能将融合蛋白洗脱下来.另外，结合缓冲液的pH值与洗脱缓冲液的pH值相差仅0.4，溶液的pH值又易受环境的影响，因此在每次实验前需精心调试，给实际操作带来诸多不便.

    随着基因组计划的进展，许多生物的基因组序列测定工作已经或即将完成.但是序列测定后，基因的功能及其表达调控的研究将成为后基因组时代最重要的任务.era基因是一个从细菌到人高度保守的小G蛋白基因.以前era基因的功能研究都局限于原核生物，难以揭示整个era基因的功能.本研究为era基因在真核生物的功能研究打下了基础.

　　:
    
　　［1］Ahnn J，March PE，Takiff HE，Inouye M.A GTP-binding pro-tein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83（3）:8849-8853.

    ［2］Chen X，Court DL，Ji X.Crystal structure of ERA:A GTPase-dependent cell cycle regulator containing an RNA binding motif ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999;96（2）:8396-8401.

    ［3］Chen SM，Court DL.Coexpression of era with rnc gene in Es-cherichia coli ［J］.Shengwu Huaxue Zazhi（Chin Biochem J），1991;7（5）:518-524.

    ［4］Britton RA，Powell BS，Dasgupta S，Sun Q，Margolin W，Lup-ski JR，Court DL.Cell cycle arrest in Era GTPase mutants:A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Es-cherichia coli ［J］.Mol Microbiol，1998;27（13）:739-775.

    ［5］Chen SM，Court DL.Purification and some biochemical proper-ties of soluble Era protein overexpressed by its recombinant gene in Escherichia coli ［J］.Shengwu Huaxue Zazhi（Chin Biochem J），1992;8（1）:33-41.

    ［6］Meier TI，Peery RB，Jaskunas SR，Zhao GS.16S rRNA is bound to era of Streptococcus pneumoniae ［J］.J Bacteriol，1999;181（17）:5242-5249.

    ［7］Wu YM，Zhang JJ，Ji ZL，Liu HP，Chen NC，Chen SM.Cloning，sequencing and expression of cDNA gene of human era ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:646-648.

    ［8］Britton RA，Chen SM，Wallis D，Koeuth T，Powell BS，Shaf-fer LG，Largaespada D，Jenkins NA，Copeland NG，Court DL，Lupski JR.Isolation and preliminary characterization of the hu-man and mouse homologues of the bacterial cell cycle gene era ［J］.Genomics，2000;67（1）:78-82.