大鼠全脑缺血再灌注损伤神经元Na+,K+

              作者：郭芳，吕平，李树民，王永利

【关键词】  Na+,,K+

　　Change of Na+, K+ATPase α isoforms in rat neurons damaged by global cerebral ischemia/reperfusion

　　【Abstract】 AIM: To investigate the change of Na+, K+ATPase α isoforms in rat neurons damaged by global cerebral ischemia/reperfusion. METHODS: The globral cerebral ischemia (15 min) in rats were induced by Pulsinelli 4VO method and the rats were reperfused for 30 min. With RTPCR and immunohistochemical assay, the expression of the Na+, K+ATPase α isoforms was detected in rat hippocampal and cortical neurons following ischemia/reperfusion. RESULTS:  The pyramidal cells during ischemia/reperfusion displayed notable edema. The α1, α2 or α3 isoform of Na+, K+ATPase distributed in a tissuespecific fashion in neurons of hippocampus and cortex, and α3 isoform was more than α2 and α1 isoforms in hippocampus, while there was no significant difference in cortex. The expressions of α1 and α3 isoforms in the rats suffering ischemia/reperfusion were significantly decreased in hippocampus (P<0.05 or 0.01). However, the expressions of α1 and α3 in cortex did not change during 15min ischemia and declined in 30min reperfusion (P<0.05). In both ischemia and reperfusion, the mRNA expressions of α1 and α3 isoforms at mRNA level had no significant change as compared with shamoperated group. CONCLUSION: The change of the expressions of α1  and α3 isoforms may involve in global cerebral ischemia/reperfusioninjury.

　　【Keywords】 Na+, K+ATPase; brain ischemia; α isoform;  reperfusion

　　【摘要】目的： 研究大鼠全脑缺血再灌注损伤后，神经元Na+, K+ATP酶α亚基三种异构体的变化. 方法： 采用四血管闭塞法（Pulsinelli 4VO）制作全脑缺血15  min再灌注30 min损伤模型，采用免疫组织化学技术和RTPCR的方法，检测缺血及再灌注损伤Na+, K+ATP酶α亚基的改变. 结果： 缺血及再灌注损伤后，神经元明显水肿；假手术组海马和皮层神经元上主要表达有α1 和α3亚基，且α3的含量较α1多，缺血15 min及再灌注30 min后，海马神经元α1和α3亚基的表达明显减少(P<0.05，P<0.01)，缺血15 min后，皮层神经元α1和α3亚基的表达无明显改变，而再灌注30 min后表达减少(P<0.05)；缺血及再灌注时α1和α3亚基在mRNA水平上的表达与假手术组相比无明显改变. 结论： Na+,  K+ATP酶 α1和α3亚基可能参与了缺血再灌注脑损伤.
 
　　【关键词】 Na+, K+ATP酶；脑缺血；α亚基；再灌注

　　0引言

　　Na+， K+ATP酶（钠泵），是存在于多种真核细胞膜上的多功能蛋白多聚体. 脑缺血缺氧后Na+,  K+ATP 酶活性降低，可导致细胞内Na+增多，渗透压升高，大量的H2O进入细胞内，造成神经元的急性肿胀、变性和坏死，导致细胞外K+增多，使细胞膜持续去极化而影响兴奋传递、递质释放等［1］. Na+, K+ATP 酶的结合，转运和药的特性取决于其α亚单位. 目前关于α亚单位在缺血再灌注损伤中的改变少见报道［2］. 我们采用RTPCR技术和免疫组织化学技术，探讨大鼠全脑缺血再灌注损伤后Na+， K+ATP酶α亚基在mRNA和蛋白水平上表达的改变，以及Na+， K+ATP酶功能异常与缺血性脑损伤之间的关系.

　　1材料和方法

　　1.1材料小鼠抗大鼠Na+， K+ATP酶α1亚单位，兔抗鼠Na+， K+ATP酶α2,  α3 亚单位多克隆抗体购于美国Santa公司；生物素标记的羊抗兔和羊抗鼠IgG，辣根酶标记链酶卵白素购于北京中山生物技术有限公司；反转录试剂盒购于美国Promega公司；其余试剂均为国产分析纯. 健康SD雄性大鼠18只，体质量250～300  g，由河北医科大学实验动物中心提供.

　　1.2方法

　　1.2.1动物分组将大鼠随机分为3组，每组6只.   假手术组： 麻醉后仅暴露双侧第1颈椎横突板，分离双侧颈总动脉，不电灼凝固双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉； 缺血组： 电灼凝固双侧椎动脉，双侧颈总动脉夹闭致全脑缺血15 min；缺血再灌注组： 电灼凝固双侧椎动脉，双侧颈总动脉夹闭致全脑缺血15 min后，松开动脉夹，恢复脑血液灌流30 min.
 
　　1.2.2模型制作四血管闭塞法（Pulsinelli 4VO）制作全脑缺血再灌注损伤（Ischemia/Reperfusion，I/R）模型［3］，水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3～0.35 g/kg）. 暴露双侧第1颈椎横突上翼小孔，电灼凝固双侧椎动脉，造成永久性关闭. 24 h后在大鼠清醒状态下，夹闭双侧颈总动脉，建立全脑缺血模型. 以大鼠1 min内昏迷、双侧瞳孔放大、翻正反射消失为缺血模型成功标准. 15 min后，松开动脉夹，恢复颈动脉血流，以此为再灌注起始点.
 
　　1.2.3HE染色缺血及再灌注达预定时间后，迅速断头取脑，沿冠状切面取视交叉后1.2～5.2 mm，将脑片迅速放入40 g/L多聚甲醛中，固定24～72 h. 常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋. 于切片机上行6 μm厚冠状切片. 切片常规脱蜡至水，苏木精染色、盐酸乙醇分色、氨水返蓝、伊红复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中型树胶封片. 于光学显微镜下观察大鼠海马和皮层神经元的形态变化.
 
　　1.2.4免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水，3 mL/L过氧化氢浸泡以阻断内源性过氧化物酶的作用，正常羊血清工作液封闭，分别用Na+，K+ATP酶α1, α2, α3 亚单位的三种多克隆抗体作为一抗，1∶50稀释，滴加后4℃过夜，次日加生物素标记的第二抗体工作液(1∶100稀释)及辣根酶标记链酶卵白素，37℃ 30 min，DAB显色，苏木素复染后，中性树胶封片，光学显微镜下观察. 采用HPIAS100高清晰病理彩色图文报告分析系统，分析各组亚基表达的变化. 每次实验均设阴性对照，以反应缓冲液代替一抗，结果显示阴性.

 
　　1.2.5RTPCR缺血及再灌注达预定时间后，迅速断头取脑，分离海马和皮层组织，分别取组织100 mg，加Trizol  1 mL，冰上静置2 min，12 000 g  4℃离心5 min，吸上清至Ependoff管，加入氯仿200 μL，剧烈震荡，冰上静置15 min， 12 000 g  4℃离心15 min，吸取上清至Ependoff管中，加入500 μL异丙醇，混匀，-20℃静置30 min，12 000 g  4℃离心10 min，弃去上清，加入750 mL/L乙醇1 mL，12 000 g  4℃离心5 min，弃去上清液，室温干燥10 min，加DEPC水20 μL混匀，取1 μL上样，10 g/L琼脂糖凝胶电泳，分析RNA完整性. 取1 μL稀释100倍，紫外分光光度计测A值与RNA浓度. RTPCR引物：α1上游引物为5′AAG GAC GCC TTT CAG AAT GCC T3′，下游引物为5′TGA CCA TGA TGA CCTT AAT CC 3′，产物长度为247 bp. α3上游引物为5′GAC CCC AAT GAC AAC CGA TA 3′，下游引物为5′CAT GGA CAT GAG ACC CAC GAA 3′，产物长度为285 bp. GAPDH 上游引物为5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC 3′，下游引物为5′TCC ACC ACC CTG TTG CTG TT 3′，产物长度为452 bp. 反转录：吸取RNA 1 μg，70℃变性10 min，取DEPC水 7.2 μL，Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，2.5 mmol/L Mg2＋  4 μL，OligdT 1 μL，RNA酶抑制剂0.5 μL，RNA 2.5 μL，AMV 0.8 μL，42℃ 15~60 min，95℃ 5 min灭活. PCR反应：Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，GAPDH上游引物
　　1.3 μL，GAPDH下游引物1.3 μL，α1 上游引物 2.2 μL，α1 下游引物1.9 μL，Taq DNA聚合酶 0.4 μL，反转录产物 2 μL，加水至50 μL，94℃预变性5 min，94℃变性40 s，45℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30个循环，72℃延伸10 min.  PCR产物6 μL，与上样缓冲液混合后进行15 g/L琼脂糖电泳，凝胶成像系统拍照， Bio1D软件进行图像分析，测定产物条带的光密度，目标产物与GAPDH的比值.
 
　　统计学处理： 实验数据用x±s表示. 采用SPSS 10.0软件进行样本方差分析及SNKq检验.

　　2结果

　　2.1海马和皮层神经元形态变化假手术组海马及皮层锥体细胞，排列整齐紧密，细胞核大而圆、透明，有1～2个明显核仁. 缺血15 min组及再灌注30 min组，锥体细胞尼氏小体消失，细胞间隙扩大，可见红色神经元，表明细胞出现明显的水肿（图1）.

　　A: 正常海马神经元形态结构；B:缺血15 min 海马神经元形态结构；C:再灌注30 min海马神经元形态结构.

　　图1缺血及再灌注损伤海马神经元的改变HE ×200（略）

　　2.2海马和皮层神经元Na+，K+ATP酶α亚基表达的变化假手术组大鼠海马和皮层神经元主要分布有Na+，K+ATP酶的α1和α3亚基，而少有α2的表达，海马神经元α3亚基的表达多于α1亚基，皮层神经元上两种亚基的表达无显著性差异. 大鼠全脑缺血15 min和再灌注30 min后，海马神经元α1和α3亚基的表达均明显减少，皮层神经元的α1亚基在缺血15 min后无明显改变，而α3亚基有明显改变，在再灌注后30 min，  α1和α3亚基均有明显减少（图2，表1）.

　　A:正常皮层神经元α1亚基的表达；B:缺血15 min 皮层神经元α1亚基的表达；C:再灌注30 min皮层神经元α1亚基的表达.

　　图2缺血及再灌注损伤海马神经元α1亚基的改变免疫组织化学染色 ×200（略）

　　表1Na+， K+ATP酶α1和α3 亚基的表达（略）

　　aP<0.05  vs假手术；  bP<0.05 vs α1亚基.

　　2.3Na+， K+ATP酶α1和α3 亚基的mRNA的表达假手术组海马神经元α3亚基mRNA的表达多于α1亚基，皮层神经元上两种亚基的表达无明显的差异. 大鼠全脑缺血15 min和再灌注30 min后，海马神经元和皮层神经元钠泵两种亚基mRNA的表达均无明显的改变（图3，表2）.

　　3讨论

　　脑组织Na+,  K+ATP 酶对缺血缺氧非常敏感，脑缺血缺氧后可致其活性降低［4］. 缺血及再灌注对Na+，K+ATP酶活性的影响有着区域性的差异，缺血后海马突触体Na+，K+ATP酶活性立即下降，而新皮层部位的酶活性却有升高趋势，再灌注后各区Na+，K+ATP酶活性均减低［5］.

　　1, 3: 海马α1亚基; 2, 4:  海马 α3亚基;  M: marker; 5, 7:  皮层α1亚基; 6, 8:  皮层α3亚基.
 
　　图3大鼠全脑缺血后脑组织Na+，K+ATP酶 α亚基RT PCR产物电泳（略）

　　表2Na+，K+ATP酶α亚基mRNA的表达（略）

　　aP<0.05 vs α1亚基.

　　我们在实验中探讨了缺血及再灌注损伤Na+，K+ATP 酶 α亚基在蛋白水平上的改变，结果表明海马和皮层α亚基在缺血及再灌注损伤中的反应性的不同，其原因可能在缺血期皮层体积较大，且血管网密度高，能量供应相对较丰富，可代偿性的维持Na+，K+ATP酶活性. 而在再灌注期则失代偿［6］. 在mRNA水平上，海马神经元和皮层神经元α亚基mRNA的表达与蛋白的表达不一致，其可能的原因① 与基因转录后调节有关，从mRNA 翻译为蛋白的过程中受到多种因素的调节,而这种转录后调节在不同亚单位间可能存在差异；② mRNA 与蛋白的半衰期不同，mRNA 极易降解,在组织内存在时间较短,而翻译成蛋白后性质相对稳定；③ 正常状态下细胞内可能有一定量的Na+，K+ATP 酶储备，不行使功能,而这种储备量的多少在不同组织中可能有所不同.
 
　　本实验表明，Na+，K+ATP酶α亚基的改变可能参与全脑缺血及再灌注损伤，Na+，K+ATP 酶的α亚单位的基因表达的调节可能是各种生理或病理状态下机体的代偿机制之一，为进一步研究Na+，K+ATP酶在脑缺血中的作用提供了理论及实验依据.

　　【】

　　［1］ Kanako H, Hiroshi M, Mitsuru S, et al. Properties of the Na+/K+  pump in small neurons from adult rat dorsal root ganglia［J］. Br J Phamacol , 2003,138 (8):1517-1527.

　　［2］ 冯仰柏,花放,耿德勤,等. CGRP 对大鼠全脑缺血再灌注ATP 酶活性的影响［J］. 中西医结合心脑血管病杂志, 2004,2(10):585-586.

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　　［4］ 文玉杰,李晓政. 钠钾ATP酶的信号转导功能新进展［J］.生理进展, 2005,36(2):159-162.

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