大鼠脊髓背根神经节内神经前体细胞的观察
作者：宋嵬，曾水林，朱建宝，王磊，李升，阎荣，李凤飞
【关键词】 ,大鼠；神经前体细胞；神经节,脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学
Observation of neural precursor cells in rat dorsal root ganglia
【Abstract】 AIM: To investigate neural precursor cells in rat dorsal root ganglia (DRG). METHODS: DRG from embryonic and adult rats were frozen and sliced for Brdu, Nestin, P75 immunofluorescence histochemical test.Additionally, the cells of ganglia were respectively cultured and observed in their proliferation and differentiation. The cells were identified by Brdu, Nestin, P75, NF and GFAP immunofluorescence histochemical test. RESULTS: In the frozen DRG sections from adult and embryonic rats, Brdu/Nestin and Nestin/P75 positive cells were found. The cultured cells could divide and proliferate and showed Nestin, Brdu, P75 positive. The thirdpassage cells could differentiate in the presence of fetal bovine serum. The differentiating cells showed NF and GFAP positive. CONCLUSION: There are neural precursor cells that can divide and proliferate in rat DRG. They can differentiate into neuron and glial cells.
【Keywords】 rats; neural precursor cells; ganglia, spinal; cell culture techniques; immunofluorescence histochemistry
【摘要】 目的： 探讨大鼠脊髓背根神经节(DRG)内是否存在神经前体细胞. 方法： 取成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片，进行Brdu, Nestin, P75免疫荧光组织化学检测，分别取成年和胚胎大鼠DRG进行原代细胞培养，观察其增殖与分化情况，并行Nestin免疫组织化学和Brdu, P75, NF, GFAP免疫荧光组织化学鉴定. 结果： 在成年和胚胎大鼠DRG冰冻切片上均见有Brdu/Nestin和Nestin/P75免疫荧光双标细胞. 细胞培养观察到取自DRG的细胞有分裂增殖，呈Nestin免疫组织化学阳性反应和Brdu, P75免疫荧光组织化学阳性反应；培养第三代细胞加入胎牛血清后出现分化，分化细胞呈NF和GFAP免疫荧光组织化学阳性反应. 结论： 大鼠DRG内存在有分裂增殖的神经前体细胞，这些细胞可以分化为神经元和神经胶质细胞.
【关键词】 大鼠；神经前体细胞；神经节，脊；细胞培养技术；免疫荧光组织化学
0引言
成年动物的中枢神经系统内存在有神经干细胞（neural stem cells, NSCs）已成为公认的事实，这些细胞可以自我更新，分裂增殖，并且向神经元与神经胶质细胞分化［1-2］. NSCs的发现给神经系统损伤的修复带来了希望. 随着研究的深入，人们认识到干细胞广泛存在于体内. 但外周神经系统是否存在NSCs的研究报道甚少. 我们用免疫组织化学和细胞培养的方法观察了成年和胚胎大鼠脊髓背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）内神经前体细胞.对哺乳动物外用内神经前体细胞进行了有益的探索.
1材料和方法
1.1材料健康孕14 d和成年SD大鼠，东南大学医学院实验动物中心提供；细胞培养主要试剂： DMEM/F12(1∶1)，N2，无血清培养液添加剂B27,表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF），碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）,胎牛血清（Gibco公司）；小鼠抗大鼠Nestin mAb, 小鼠抗大鼠NF mAb，小鼠抗大鼠BrdU mAb，兔抗大鼠GFAP多克隆抗体（Sigma公司）;羊抗小鼠SAP试剂盒，BCIP/NBT染色试剂盒（北京中杉公司）;兔抗大鼠P75多克隆抗体，山羊抗小鼠IgG: FITC,山羊抗小鼠IgG: TRITC,山羊抗兔IgG: TRITC（武汉博士德公司）.
1.2方法
1.2.1切片制备与染色取孕14 d和成年大鼠于处死前3 d，分别给予BrdU mAb腹腔注射2次(每次50 mg/kg). 于深麻下，打开胸腔，先后用生理盐水和40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液进行升主动脉灌注. 取出DRG，置于40 g/L多聚甲醛内后固定，次日行冰冻切片，片厚15 μm. 将切片分为三套，分别行HE染色和BrdU/Nestin, P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色.
HE染色： DRG切片入苏木精染液染色，水洗玻片上多余染液，10 mL/L盐酸乙醇分色. 流水冲洗，反蓝. 蒸馏水冲洗；1～5 g/L伊红染液染色，依次经700, 850, 1000 mL/L乙醇脱水；二甲苯透明，封片.
BrdU/Nestin双标免疫荧光组织化学染色：依次加入500 mL/L甲酰胺，2×SSC, 1 mol/L盐酸, 1 g/L胰蛋白酶及封闭羊血清后，再加入小鼠抗大鼠BrdU抗体（1∶200），4℃过夜,加入山羊抗小鼠IgG: TRITC（1∶300），加封闭羊血清，加小鼠抗大鼠Nestin抗体（1∶200），4℃ 8 h，加山羊抗小鼠IgG: FITC（1∶300），甘油缓冲液封片.
P75/Nestin双标免疫荧光组织化学染色： 依次加封闭羊血清，兔抗大鼠P75抗体（1∶200）， 4℃过夜，加入山羊抗兔IgG: TRITC（1∶300），小鼠抗大鼠Nestin抗体（1∶200），4℃ 8 h，山羊抗小鼠IgG:FITC（1∶300），甘油缓冲液封片.
1.2.2背根神经节细胞原代培养取孕14 d大鼠于麻醉后取出胚鼠,分离出DRG，DMEM液冲洗，剪碎，放在300目的滤网研磨过滤. 收集过滤液，离心5 min，1000 r/min. 弃去上清. 再次离心后，所得细胞用含有EGF，bFGF的DMEM重悬. 将细胞以1×108/L浓度接种于10 mL培养瓶内. 置于培养箱中培养（37℃, 50 mL/L CO2）.
取成年大鼠麻醉后，脱颈处死消毒，解剖分离出DRG. 将收集到的神经节组织进行原代细胞培养（方法同前）.
1.2.3细胞传代培养在细胞培养到7 d时,用2.5 g/L的胰酶消化5 min,加入100 mL/L胎牛血清终止消化，再用吸管吹打成单细胞悬液，离心弃上清，反复两次. 所得细胞用前述培养液重悬. 将一部分细胞悬液调整成密度为1×108/L，种入新的培养瓶中，继续按照先前条件，置于培养箱培养. 另取一部分细胞悬液,用培养液稀释到2×103/L，接种入96孔培养板中,每孔100 μL. 2 h后在倒置显微镜下观察，对只有一个细胞的培养孔做标记. 以后每天动态观察标记孔中单细胞的分裂和克隆形成情况. 在细胞分裂增殖到一定程度后，按照同样的方法进行第二次传代.
1.2.4培养细胞的鉴定选择第二次传代后有细胞增殖的培养孔，分为三组，前两组分别加入5 μmol/L的BrdU, 100 mL/L胎牛血清，第三组不加任何物质. 继续培养3 d后,对加入BrdU的培养孔中的细胞进行抗BrdU的免疫荧光组织化学染色（TRITC标记）. 对加入胎牛血清的培养孔的细胞分别进行GFAP,NF的免疫荧光组织化学染色（GFAP用TRITC标记，NF用FITC标记）. 第三组进行Nestin免疫组织化学染色（SAP法），苏木素复染.
上述切片和培养细胞分别在普通和荧光显微镜、倒置显微镜下观察，并照相记录.
2结果
2.1HE染色在低倍光镜下可见，整个DRG呈梨形，其外膜的结缔组织伸入节内，把节内细胞分成多群. 在高倍光镜下，节内细胞多数呈圆形，体积较大，胞质嗜酸性，胞核大而圆，嗜碱性，染色浅，核仁清楚. 围绕胞体外周有一层扁平或立方形细胞即卫星细胞. 在细胞群之间可见到大量神经纤维（图1）.
图1成年大鼠背根节HE染色×100（略）
2.2免疫荧光组织化学检测TRITC和FITC分别标记的BrdU, Nestin免疫荧光抗体检测显示，在胚胎鼠和成年大鼠的神经节内均可见BrdU, Nestin和BrdU/Nestin免疫荧光单标和双标细胞. BrdU单标细胞核圆形，较大，呈红色，散在分布于节内；Nestin单标细胞圆形或椭圆形，呈绿色；BrdU/Nestin双标细胞显示为红色的核和绿色的胞体，核质比高（图2）. 用同样方法也可以检测P75/Nestin双标细胞，P75单标细胞呈红色，大小不等，圆形；Nestin单标细胞为绿色；双标细胞呈棕黄色，散在分布于各细胞群之间，多呈圆形，胞体中等大小，有的可见突起，胞核较大（图3）.
图2成年大鼠背根节BrdU/Nestin免疫组织荧光化学染色×400（略）
图3胚鼠背根节P75/Nestin免疫组织荧光化学染色×400（略）
2.3原代细胞培养DRG细胞悬液原代培养后第2日即可见圆形、折光性较强的细胞，细胞小而透明. 随着培养天数的增加，细胞数量逐渐增多，可见呈分裂相的细胞和细胞团. 继之细胞形态变大，有的细胞呈悬浮状态. 到7~10 d时，可见到大部分呈葡萄串状或桑椹状的细胞团，体积较小，细胞团内的细胞呈圆形，大小不一；少部分呈散在成群分布，细胞多数为梭形，伸出2~3个突起. 培养到20 d时，可见到一种单个巨大的圆形或椭圆形细胞，有的上称之谓“O细胞”［3］. 细胞传代后生长速度变慢，有一部分细胞会停止生长. 成年鼠与胚胎鼠DRG培养的细胞形态上未见有明显差异，但胚鼠生长速度快于成年鼠.
2.4培养细胞的鉴定对传代两次后的培养细胞行免疫组织化学染色显示，这些细胞呈Nestin阳性，细胞呈梭形或多角形，有突起，核大而深染(图4). 免疫荧光组织化学检测，在加入BrdU的培养孔内可见BrdU阳性细胞，细胞核圆，较大，在荧光显微镜下发出红光. 在加入胎牛血清的培养孔内，可见GFAP和NF阳性细胞，GFAP阳性细胞呈红色，形态不规则，突起较多且长；NF阳性细胞呈绿色，胞体较大，圆形或多角形，突起少并且短（图5,6）.
3讨论
从起源上来说，DRG来自神经嵴. 神经嵴细胞是一种多能干细胞，其衍化物具有3个经典胚层衍化物的性质. 据报道［4-5］，在成年动物的胃肠道和皮肤组织中仍然存在着神经嵴细胞. 在生后15 d大鼠的胃肠中存在的神经嵴细胞仍然具有向TH阳性神经元分化的能力. 表皮内存在的神经嵴细胞也具有比较高的可塑性，可以分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞和黑色素细胞. 本实验通过免疫组织化学和细胞培养的方法发现在大鼠的DRG内亦存在有分裂增殖能力，并可以向神经元和神经胶质细胞分化的神经前体细胞. 说明神经前体细胞不但存在于中枢神经系统，也存在于周围神经系统.
图4成年大鼠背根节传代培养细胞Nestin免疫组织化学染色，苏木素复染×200（略）
图5成年大鼠背根节传代培养细胞分化后GFAP免疫荧光组织化学染色×400（略）
图6成年大鼠背根节传代培养细胞分化后NF免疫荧光组织化学染色×400（略）
P75是低亲和力神经营养因子受体，有报道把它作为神经嵴细胞的标志物［6］. 在大鼠的神经节内检测到Brdu/Nestin和P75/Nestin双标细胞,说明在神经节内可能存在着具有原始特性的神经前体细胞. 这些前体细胞培养后为球形，梭形或多角形. 单个细胞不断分裂后可以形成克隆. 其子代细胞可以在一定条件下发生分化. 决定NSCs定向分化的机制有两种:一是细胞自身基因调控;另一种是外来信号调控和NSCs所处的内环境［7-9］. 在向培养细胞中加入胎牛血清后，对其进行的GFAP和NF的免疫荧光组织化学染色表明，培养细胞当中出现了较多的具有神经胶质样和神经元样细胞.
与中枢的NSCs培养相比，DRG内细胞培养有两个不同： ① 不形成典型的“神经球”，克隆的形态呈较小的桑椹状，葡萄串状或散在成群状. ② 细胞之间连接松散. 在DRG培养的细胞传代时，用胰酶消化法和机械分离法分离细胞都比分离中枢的神经干细胞球容易.
对胚鼠和成年鼠的背根节细胞培养进行比较，也存在有差异. ① 胚鼠的原代培养细胞生长得更快. ② 胚鼠的原代细胞形成的克隆数多于成年鼠. ③ 胚鼠O细胞产生的数目往往更多. 这种体积巨大的细胞很可能发育为非神经细胞，如黑色素细胞等. 在有关神经组织标志物免疫组织化学检测时O细胞表现为阴性结果［3］. O细胞的出现以及其在发育不同阶段的数量变化有何意义，目前尚不清楚. 但无论是胚鼠还是成年鼠的培养细胞，传代以后其生长速度都会减慢，传代后两者生长速度基本相同. 另外随着培养时间的延长，细胞的增殖能力也逐渐减弱. 神经嵴细胞的发育是具有时间性和空间性的［10］，那么作为其后代的神经节内神经前体细胞，其增殖能力和分化的潜能有多大，受哪些因素的调控，能否作为神经系统疾病细胞替代的供体等，尚须做大量的研究.
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