氯氨酮减轻高血糖大鼠脑缺血所致的神经元凋亡
作者：张建忠，景丽，郭风英，马轶，王一理
【关键词】 高血糖症；脑缺血；氯胺酮；细胞外信号调节MAP激酶类；细胞凋亡；免疫组织化学；免疫印迹法
Role of ketamine in decreasing neuronal apoptosis caused by brain ischemia in rats with hyperglycemia
【Abstract】 AIM: To investigate the mechanism by which ketamine reduces the aggravation of hyperglycemiainduced cerebral ischemic lesion. METHODS: Rats with normoglycemia, hyperglycemia, or hyperglycemia pretreated with ketamine injection were subjected to 15 min of global brain ischemia, and then reperfused for 0.5, 1, and 3 h, respectively. Phosphorylation of extracellular signalregulated kinase (ERK)1/2 was assessed by immunohistochemistry and Western blot analysis. Meanwhile, the neuronal apoptosis was observed by TdTmediated dUTP nickend labeling (TUNEL). RESULTS: The phosphorylation of ERK1/2 in the regions of cingulum cortex, hippocampus CA1 and CA3, were significantly increased in ischemic rats with normoglycemia reperfused for 0.5 h. Compared to the normoglycemic group, the phosphorylation of ERK1/2 in the regions of cingulum cortex and hippocampus CA3 were also significantly increased in hyperglycemic group reperfused for 0.5 h, which lasted to 3 h of reperfusion. However, this augmentation of phosphorylation was depressed by ketamine administration in hyperglycemic rats. The extent of ERK1/2 phosphorylation was consistent with the ischemic brain lesions, observed by histology as neuronal apoptosis. CONCLUSION: Hyperglycemia may increase the ischemic insult via the modulation of ERK1/2 signal transduction pathways. Ketamine improves the aggravation of hyperglycemiainduced cerebral ischemic lesion. This is probably mediated by inhibition of NMDAmediated calcium influx, and hyperglycemiainduced phosphorylation of ERK1/2.
【Keywords】 hyperglycemia; brain ischemia; ketamine; extracellular signalregulated MAP kinases; apoptosis; immunohistochemistry; immunoblotting
【摘要】目的： 探讨氯氨酮减轻高血糖加重脑缺血损伤的机制. 方法： 在正常血糖、高血糖以及氯氨酮干预条件下，制作大鼠全脑缺血15 min，再灌注0.5，1和3 h模型. 通过免疫组化和免疫印迹技术对比研究细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）的磷酸化，同时采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记方法观察神经细胞凋亡. 结果： 正常血糖组大鼠全脑再灌注0.5 h扣带皮质和海马CA1及CA3区的ERK1/2磷酸化明显增加；在高血糖组缺血再灌注后0.5 h，扣带皮质和海马CA3区的ERK1/2磷酸化明显高于正常血糖组，持续到再灌注后的3 h；氯氨酮组可见由高血糖诱导的ERK1/2磷酸化被抑制. 同时，磷酸化ERK1/2的程度与脑组织损伤结果一致. 结论： 高血糖可通过ERK1/2信号转导通路加重缺血性脑损伤，氯氨酮通过阻断NMDA受体，改善钙离子异常而抑制高血糖介导的ERK1/2磷酸化，从而减轻高血糖加重缺血性脑损伤.
【关键词】 高血糖症；脑缺血；氯胺酮；细胞外信号调节MAP激酶类；细胞凋亡；免疫组织化学；免疫印迹法
0引言
新近的研究显示，高血糖可通过磷酸化激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases, MAPK）信号通路，加重缺血导致的脑组织损伤［1-2］. 脑缺血及再灌注后神经元的死亡与多种机制有关，包括兴奋性氨基酸谷氨酸的释放，钙离子超载及自由基产生等［3-4］. 由于谷氨酸刺激引起的N甲基D天冬氨酸（NmethylDaspartate, NMDA）受体功能上调能够导致钙离子大量内流，使MAPK激活，引起缺血和再灌注损伤［5］. 目前针对损伤机制开展的神经保护也在不断探索［6］. 推测氯氨酮作为NMDA受体阻断剂能够阻断其功能的上调，减少钙离子内流，通过抑制MAPK信号通路的激活而减轻脑组织损伤［7］. 为进一步证明此推测，我们通过免疫组化和免疫印迹等方法，采用大鼠全脑缺血15 min和再灌注0.5，1和3 h 模型，对比观察氯氨酮对高血糖加重缺血性脑损伤的影响和细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signalregulated kinase 1/2，ERK1/2）磷酸化的关系.
1材料和方法
1.1材料雄性SD大鼠65只，体质量300~350 g，由宁夏医学院实验动物中心提供；抗磷酸化ERK1/2 mAb，氯氨酮，连接有辣根过氧化物酶的抗鼠第二抗体，末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记（TdTmediated dUTP nickend labeling，TUNEL）试剂盒(美国Sigma)；BCIP(5bromo4chloro3indolylphosphate）(美国Promega)，硝基蓝四氮唑(Promega)，硝酸纤维素膜(Amersham)和其他常用试剂，均购自上海华美公司和武汉博士德公司；链霉素亲生物素过氧化酶（streptavidinperoxidase, SP）试剂盒（美国Zymed）购自北京中杉生物技术公司.
1.2方法
1.2.1动物模型制造实验分为4组： ① 高血糖脑缺血组（高血糖组）；② 高血糖氯氨酮干预脑缺血组（氯氨酮组）；③ 正常血糖脑缺血组（正常血糖组）. 以上各组再分缺血15 min，再灌注0.5, 1和3 h 4个小组，每小组各5只；④ 空白对照组5只. 在高血糖组，于缺血手术前30 min注射250 g/L葡萄糖使血糖浓度达到20 mmol/L左右；在氯氨酮组，于缺血手术前20 min尾静脉注射氯氨酮50 mg/kg，高血糖和正常血糖组注射同量的9 g/L生理盐水. 全脑缺血模型按［1］的方法制造. 30 mL/L 氟烷诱导麻醉，尾动脉和静脉插管分别用于测定血压和采取血样及给药. 分离并结扎双侧颈总动脉，颈静脉插管放血使血压保持在45~50 mmHg，当脑电图保持平直时为脑缺血成功的标志. 在缺血15 min末解除结扎，同时通过颈静脉回输血液进行再灌注. 在设定的各时间点收集脑标本，大脑从正中切断，一半置液氮冷冻用于免疫蛋白印迹(Western blot)分析，另一半置于40 g/L多聚甲醛中固定，用于组织病和免疫组化检查.
1.2.2免疫组织化学脑组织切片5 μm进行免疫组化染色. 切片脱蜡至水，进行微波炉抗原热修复；30 mL/L过氧化氢处理消除内源性过氧化物酶；非免疫正常羊血清处理；加抗磷酸化ERK1/2的mAb (1∶400) 4℃过夜；山羊抗鼠的连接辣根过氧化物酶的IgG (1∶2000)室温下孵育10 min；PBS冲洗后加二氨基联苯胺（DAB）和H2O2显色8 min；冲洗后苏木素衬染. TUNEL染色按照产品使用说明书进行，荧光显微镜观察后，用DAB显色.
在高倍镜下观察计数TUNEL染色阳性(凋亡神经元)以及免疫组化染色阳性的神经元，每张切片分别在扣带回观察10个高倍镜视野，海马CA1及CA3区观察1 mm2区域.
1.2.3凝胶电泳和Western blot扣带回和海马组织标本在缓冲液中匀浆离心取上清液冷冻待测. 等量蛋白样品100 g/L聚丙烯酰胺钠凝胶电泳分离后，将蛋白质通过电转移系统转移到硝酸纤维素膜上，用含有50 g/L脱脂牛奶的TBS缓冲液进行封闭，然后加入抗磷酸化ERK1/2的一抗（1∶1000稀释）孵育4℃过夜，然后与结合辣根过氧化酶的抗鼠第二抗体（1∶2000）室温1 h. 用ECL化学发光剂增强显色，目标蛋白质带的吸光度值（空白对照组的%）采用BIORAD生物医学图像分析系统进行分析.
统计学处理：实验数据用x±s表示，采用SPSS10.0统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSDt检验. 以P<0.05认为有统计学意义.
2结果
2.1脑损伤的组织学观察对照组脑组织结构完整，分布均匀，细胞和血管周围无空隙，偶见TUNEL染色阳性神经元. 在正常血糖组，扣带回、海马CA1和CA3区从缺血15 min到再灌注3 h可见变性及凋亡神经元；在高血糖组，扣带回、海马CA3区在缺血15 min和再灌注0.5 和1 h后变性和凋亡神经元明显增加，特别是缺血再灌注1 和3 h后扣带回和海马CA3区神经元凋亡明显多于正常血糖组；氯氨酮组计数结果与正常血糖组相似，神经元凋亡少于高血糖组（表1）.
表1扣带回凋亡神经元计数(略)
aP<0.05 vs正常血糖，氯氨酮.
2.2磷酸化ERK1/2免疫组化检查在正常血糖组扣带回皮质，再灌注0.5 h后磷酸化ERK1/2轻度上调，1 和3 h后磷酸化ERK1/2阳性神经细胞明显多于空白对照组（图1）；在高血糖组再灌注0.5 h后磷酸化ERK1/2明显多于正常血糖组，此上调现象一直持续到再灌注1 和3 h；在氯氨酮组，缺血15 min再灌注0.5，1和3 h磷酸化ERK1/2阳性神经细胞数量与正常血糖组比较接近，明显低于高血糖组. 在正常和高血糖组以及氯氨酮组，海马CA1区在缺血再灌注各时间点ERK1/2磷酸化表达均无显著差异，而CA3区磷酸化ERK1/2有明显不同的表达（图2），高血糖组再灌注0.5 h后磷酸化ERK1/2明显高于正常血糖组，而氯氨酮组明显低于高血糖组，高血糖诱导的ERK1/2磷酸化被氯氨酮抑制.
A：空白对照组，无明显阳性神经元；B：正常血糖组，可见阳性染色神经元； C：高血糖组，阳性染色神经元增多； D：氯氨酮组，阳性染色神经元明显减少.
图1扣带回缺血再灌注3 h磷酸化ERK1/2免疫组化检查DAB ×400（略）
2.3凝胶电泳和Western blot分析正常血糖组再灌注0.5 h后扣带皮质和海马激活的ERK1/2轻度增加（图3）；在高血糖组再灌注0.5，1和3 h后则明显增加，半定量分析显示高血糖组明显高于正常血糖组（表2）；在氯氨酮组，再灌注0.5，1和3 h可明显减轻ERK1/2的磷酸化，与正常血糖组相似，再灌注0.5 h后ERK1/2明显上调，至1 和3 h后下降到正常血糖组水平.
3讨论
高血糖加重缺血性脑损伤的机制仍然不清楚，通过信号转导途径介导的损伤加重也受到了更大的关注. 本研究结果显示，高血糖条件下脑缺血时神经元凋亡明显多于正常血糖组，在高血糖组缺血再灌注0.5 h后磷酸化ERK1/2明显增加，ERK1/2磷酸化 A：空白对照组，偶见阳性神经元；B：正常血糖组，可见大量阳性神经元； C：高血糖组，阳性神经元明显增多；D：氯氨酮组，阳性神经元明显减少.
图2海马CA3区缺血再灌注3 h磷酸化ERK1/2免疫组化染色DAB ×400（略）
A： 正常血糖组；B： 高血糖组；C： 氯氨酮组. M： 标准分子量蛋白质. 1：缺血15 min；2：再灌注0.5 h；3：再灌注1 h；4：再灌注3 h；5：空白对照组.
图3脑组织磷酸化ERK1/2凝胶电泳图（略）
表2磷酸化ERK1/2吸光度测定（略）
aP<0.05 vs正常血糖，氯氨酮； bP<0.05 vs正常血糖.
与神经元凋亡的分布及其程度相一致. 提示高血糖能增加缺血导致的神经元凋亡，高血糖诱导的ERK1/2磷酸化激活介导了神经元凋亡［1-3］.
研究证明，细胞内钙离子持续增高可导致各种降解酶激活，使神经细胞逐步死亡；钙离子浓度升高可激活一氧化氮合成酶使一氧化氮产生增加，对缺血区脑细胞毒性作用增加；过量钙离子沉积于线粒体，使线粒体氧化磷酸化失偶联，抑制细胞呼吸，导致神经细胞损伤死亡. 糖尿病高血糖可导致细胞内游离钙离子浓度升高，这可能与Ca2+ATP酶的失活和蛋白激酶C的激活有关，一方面高血糖直接抑制了Ca2+ATP酶的活行，使细胞外的Ca2+进入细胞内，由于酶的糖基化抑制了Ca2+ATP酶活性，同时高糖也抑制了Na+/ Ca2+交换和Na+K+ATP酶的活性，另一方面，NMDA受体激活所导致的钙离子大量内流是脑缺血再灌注损伤的重要机制［5-8］.
对脑缺血后损伤的预防和研究提示，具有神经保护作用的物质可能通过各种不同的途径和机制保护脑组织，例如CXC ligand 8可通过抑制嗜中性粒细胞的活性减轻缺血性脑损伤［9-10］. 据报道，NMDA受体激活所导致的钙离子大量内流是脑缺血再灌注损伤的重要机制，而NMDA受体活性抑制可减轻缺血所导致的神经元损伤，氯氨酮仅抑制ERK1/2的磷酸化，但不影响JNK的磷酸化［7］. 本研究结果可见，高血糖条件下脑缺血前使用氯氨酮能够减少神经元的凋亡，减轻ERK1/2磷酸化. 提示氯氨酮可能通过抑制NMDA受体活性而阻止钙离子内流，从而减轻ERK1/2磷酸化激活，这与钙通道阻止剂预防酪氨酸酶磷酸化的结果一致［5］. 氯氨酮能够抑制高血糖介导的缺血再灌注脑损伤，具有与MAPK家族成员特异性抑制剂U0126和SB203580相似的功能［4-8］，将有可能成为高血糖脑缺血性损伤的抑制剂. 但是，高血糖诱导加重脑缺血性结构损伤的机制比较复杂，所以，氯氨酮作为高血糖条件下脑缺血的治疗剂仍需要进一步研究［7］.
【】
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