结核分枝杆菌RpfA蛋白的表达纯化与鉴定
【关键词】 RpfA；表达；纯化；分枝杆菌,结核
Expression, purification and identification of Mycobacterium tuberculosis RpfA
【Abstract】AIM: To express efficiently Mycobacterium tuberculosis RpfA in E. coli and purify the fusion proteins. METHODS: RpfA gene segments were digested with NdeI and BamHI and cloned into pcDNA3.1+ vector. After sequencing, RpfA were subcloned into the prokaryotic expression vector pET19b to get pET19bRpfA. The plasmid pET19bRpfA were transformed into E. coli DE3 and induced by IPTG for its expression. The RpfA fusion protein expression was analyzed by SDSPAGE and confirmed by Western blot. Recombinant (His)6 fusion proteins were purified via Ni2+NTA affinity chromatography. RESULTS: RpfA gene segments were identical to that GenBank reported (lacking 5′ ends of 99 bp). The pET19bRpfA vector expressed RpfA fusion proteins at Mr about 80 ku, which could be caught by anti(His)6 mAb ,antiRv1884 and antiRv2389 immune serum.SDSPAGE analysis showed that the fusion proteins mainly existed in inclusion bodies.The expressed proteins could be purified via Ni2+NTA affinity chromatography in denatured condition. CONCLUSION: The recombinant expression plasmid pET19bRpfA has been constructed and RpfA fusion proteins been successfully expressed in E. coli and purified, which lay a basis for further study of RpfA functions.
【Keywords】 RpfA; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis
【摘要】 目的： 表达和纯化RpfA融合蛋白. 方法： 将含有RpfA基因片段的质粒用NdeI与BamHⅠ双酶切,然后将目的基因片段克隆入pcDNA3.1+ 载体构建重组载体pcDNA3.1+ RpfA，测序正确后再将目的基因片段亚克隆入pET19b原核表达载体并转化E.coli DE3，IPTG诱导表达融合蛋白， Western blot 鉴定融合蛋白. 在变性条件下Ni2+NTA 亲和色谱柱纯化目的融合蛋白. 结果： 目的基因片段测序与Genbank报道一致（切去了5′端99 bp）. SDSPAGE显示，在Mr约为80 ku处有表达条带，Western blot鉴定为(His)6融合蛋白，并与小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清有交叉反应. 可溶性分析发现融合蛋白主要以包涵体形式存在. 经Ni2+NTA亲和色谱柱纯化得到了融合有6个组氨酸残基的RpfA融合蛋白. 结论： 成功构建了pET19bRpfA表达载体，并在E.coli DE3中高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白.
【关键词】 RpfA；表达；纯化；分枝杆菌，结核
0引言
复活促进因子（resuscitation promoting factor, Rpf）最早在藤黄微球菌中发现，它可以促进休眠期结核分枝杆菌的生长［1］. Rpf样蛋白广泛存在于革兰氏阳性菌中，并参与革兰氏阳性菌生物活性［2］. RpfA（Rv0867c）是结核分枝杆菌Rpf家族五种蛋白（AE）中的一员［3］. 在对Rpf家族其他成员的研究中发现Rpf样蛋白不仅与细菌的增殖有关，还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原［4-5］. 我们表达并纯化RpfA融合蛋白，以期进一步研究RpfA融合蛋白刺激细菌增殖功能的作用机理和自身的免疫学特性，评价其作为快速培养检验结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis, MTB）的候选组分的可能性.
1材料和方法
1.1材料含RpfA基因片段的质粒由Mike Young教授惠赠（University of Wales, Cardiff,United Kingdom）；pcDNA3.1+ 载体与 Ni2+NTA Purification System（美国Invitrogen公司）；pET19b载体（美国Novagen公司）；E.coli DE3菌株为第四军医大学微生物学教研室保存；限制性内切酶NdeI, BamHI与T4 DNA连接酶（大连TaKaRa 公司）；IPTG（美国Sigma 公司）；质粒微量提取试剂盒与胶回收试剂盒（美国Omega公司）；PVDF膜（美国Millipore公司）；抗His标签mAb（北京天为时代公司）；小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清（切去His标签）为第四军医大学微生物学教研室制备.
1.2方法
1.2.1基因片段的测序鉴定将含有目的片段的质粒用NdeI和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段条带. 再将纯化的回收产物与经同样酶切的pcDNA3.1+ 载体进行连接,转化感受态E.coli DE3，均匀涂布于含有100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养16 h，随机挑取克隆进行酶切鉴定，将酶切正确的克隆送至上海博亚生物工程有限公司进行序列测定.
1.2.2目的蛋白的诱导表达测序结果正确的质粒经NdeI和BamHI双酶切后，回收目的片段，与经同样酶切的pET19b载体进行连接，转化感受态E.coli DE3，随机挑取4个克隆进行酶切鉴定. 把酶切鉴定正确的阳性克隆接种在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB培养液中37℃振摇过夜，然后按1∶25的接种量进行转接，37℃振摇3 h后加入异丙基βD硫代半乳糖苷( IPTG) 至终浓度为1.0 mmoL/ L ，37℃继续培养4 h. 取1. 0 mL细菌培养物，离心1 min收集菌体，加入2 ×样品缓冲液剧烈振荡混匀，100 ℃煮10 min后12 000 g离心10 min；取上清进行SDSPAGE 电泳检测，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量.
1.2.3表达产物鉴定所构建的重组质粒表达的RpfA蛋白是带有6 个组氨酸标签的融合蛋白，而且表达的RpfA蛋白是与Rpf家族其它蛋白高度同源的，都含有关键的Rpf样结构域［6］. 将经过诱导的细菌制成样品，进行100 g/L SDSPAGE电泳，并转移至PVDF膜上，用10 g/L BSA封闭过夜，分别加入抗组氨酸标签的特异性mAb，小鼠抗Rv1884免疫血清，小鼠抗Rv2389免疫血清作用1 h，以10 mmol/L PBS（pH 7.2）洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG作用1 h，以DAB显色观察表达产物. 分别以未诱导细菌裂解物，第四军医大学微生物学教研室制备的ESAT6MPT64融合蛋白为阴性对照.
1.2.4表达蛋白的可溶性分析大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声波破碎细菌. 12 000 g离心10 min后将上清和沉淀分别制样，进行SDSPAGE分析.
1.2.5表达产物的纯化采用Invitrogen的Ni2+NTA纯化试剂盒纯化目的蛋白. 将50 mL的诱导菌液离心，制备上柱样品，按照变性条件进行亲和色谱纯化，收集洗脱液进行SDSPAGE 分析.
2结果
2.1RpfA基因片段的序列测定含有目的基因片段的质粒用NdeI和BamHI双酶切，得到大小约为1125 bp的片段（图 1），将回收后的目的片段克隆入pcDNA3.1+ 载体，挑选酶切鉴定正确的克隆，经正反向全自动测序后证实目的片段序列与切去N末端99 bp信号肽编码序列后的Genbank序列完全一致.
M: DNA marker (DL2000)；1: PlasmidRpfA.
图1含RpfA基因片段质粒酶切鉴定（略）
2.2表达载体的酶切鉴定将重组质粒pcDNA3.1+RpfA经NdeI和BamHI双酶切后，回收目的片段，与经同样酶切的pET19b载体进行连接，转化感受态E.coli DE3，随机挑取4个克隆进行酶切鉴定，其中2, 3, 4号克隆切出目的大小的片断，命名为pET19bRpfA2, 3, 4（图 2）.
M: DNA marker(DL 2000) ；1~4: pET19b RpfA质粒.
图2pET19b RpfA 质粒酶切鉴定（略）
2.3RpfA融合蛋白的表达将重组质粒转化E.coli DE3, 1 mmol/L IPTG诱导4 h，进行100 g/L SDSPAGE，从电泳图中可以看见在Mr约为80 ku处出现表达带，而未诱导的细菌没有表达带出现（图 3）.
2.4融合蛋白的鉴定将诱导细菌裂解物分别与抗组氨酸的特异性mAb，小鼠抗Rv1884免疫血清和抗Rv2389免疫血清做免疫印记. 结果显示在Mr约为80 ku处有一显色带，而未诱导对照，纯化的ESAT6MPT64融合蛋白阴性对照没有显色（图 4）.
2.5表达蛋白的可溶性分析与纯化将细菌裂解产物的上清和沉淀分别所制样品，进行SDSPAGE分析，表明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中则很少. Ni2+NTA 亲和色谱柱纯化蛋白后SDSPAGE分析可发现在Mr约为80 ku处有一条清晰的条带（图 5）.
M: 标准分子量蛋白；1: 诱导的E.coli DE3；2: 未诱导的E.coli DE3工程菌；3~4: 诱导的E.coli DE3工程菌.
图3 (His)6 RpfA融合蛋白的表达（略）
M: 标准分子量蛋白；1: 诱导的E.coli DE3工程菌与抗Rv1884免疫血清；2: 纯化ESAT6MPT64蛋白与抗Rv1884免疫血清； 3: 诱导的E.coli DE3工程菌与抗Rv2389免疫血清；4: 纯化ESAT6MPT64蛋白与抗Rv2389免疫血清；5: 诱导的E.coli DE3工程菌与抗His标签mAb；6: 未诱导的E.coli DE3工程菌与抗His标签mAb.
图4RpfA融合蛋白与小鼠抗Rv1884免疫血清、抗Rv2389免疫血清和抗His标签mAb免疫印记（略）
M： 标准分子量蛋白；1： 菌体裂解物沉淀；2： 菌体裂解物上清；3： 未诱导的E.coli DE3工程菌；4： 诱导的E.coli DE3工程菌；5： 纯化的RpfA融合蛋白.
图5(His)6 RpfA融合蛋白的纯化与可溶性分析（略）
3讨论
RpfA基因全长1224 bp，表达的RpfA蛋白是一种分泌型蛋白，包括有N末端信号肽，Rpf样结构域，富含脯氨酸丙氨酸重复序列. 我们表达的融合蛋白切去了N末端33个氨基酸的信号肽，以利于表达融合蛋白，因此用pET19b载体表达理论Mr应该约为40 ku，但是我们看见诱导表达的条带却是在Mr约为80 ku位置. 为了鉴定所表达的蛋白是否是我们所需要的蛋白，我们先用小鼠抗His标签mAb对表达产物进行免疫印记，在Mr约为80 ku处出现单一条带，而空载体诱导的菌体裂解物没有显色条带；为了进一步鉴定所获的融合蛋白，我们随后又分别用小鼠抗Rv1884和抗Rv2389免疫血清（均已切除了His标签）对诱导细菌裂解物进行免疫印记，以纯化的重组结核杆菌ESAT6MPT64蛋白作为阴性对照，结果都在Mr约为80 ku处出现单一条带，而阴性对照没有出现条带. 因此我们认为所表达的蛋白就是我们所需要的蛋白. SAPS（www.isrec.isbsib.ch/software/SAPS_form.html）分析发现RpfA蛋白P123P371集中了75个脯氨酸，中间包含了大量的重复序列LAPPAP，而脯氨酸是唯一的一种环状氨基酸. 因为它的环状结构，刚性很强，它的出现都是肽链方向的改变，因此在高密度重复出现脯氨酸时，肽链既不能形成α螺旋也不能形成β折叠，只能形成长链的无规则卷曲. 3DJIGSAW（www.bmm.icnet.uk/servers/3djigsaw/）分析也预测了这一点. 因此在形成SDS蛋白质复合物时，按照“项链”模型理论［7］，SDS在中央，结合的肽链弯曲形成环状在外围，而环的直径决定了复合物在聚丙烯酰胺凝胶中的泳动速率，由于RpfA蛋白富含脯氨酸丙氨酸重复序列，造成环的弯曲受限，从而导致环的直径变大，导致了泳动速率的下降，在SDSPAGE电泳上就表现为分子量明显增加. Mukamolova等［8］用抗Rpf样结构域抗体对MTB和BCG培养上清浓缩液作免疫印记，也发现在Mr约为80 ku处有表达条带，因此我们的判断完全是有理由的. 而且后续的实验已经显示纯化的RpfA融合蛋白对BCG和H37Ra的生长有刺激作用.
【】
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