高碘对桥本甲状腺炎大鼠TRAIL表达的影响
作者：张雅萍，帖丽丽，张南雁，姬秋和
【关键词】 碘；TRAIL；甲状腺炎,自身免疫性
Effect of iodine excess on TRAIL expression in rats with Hashimotos thyroiditis
【Abstract】 AIM: To explore the significance of the expression of TRAIL in the pathogenesis and pathological changes in the situation of iodine excess in rats with experimental autoimmune thyroiditis(EAT). METHODS: Female SD rats were applied as EAT animal models and fed on highiodine diets in this study. Immunohistochemical methods were used to detect the expression and distribution of TRAIL in highlevel iodine in EAT rats. RESULTS: The positive rates for TRAIL in thyrocytes of rats increased in the order of normal control group, EAT model group and EAT iodine excess group(P<0.05). Strongly positive immunostained thyroid follicular cells of EAT rats for TRAIL mainly distributed adjacently to infiltrating lymphocytes. Staining of infiltrating lymphocytes for TRAIL was found to be rather weak or even absent. CONCLUSION: High characteristic expression of TRAIL in thyroid follicular cells in EAT rats is significant, especially in the presence of iodine excess, which indicates that highiodine diet might induce thyrocyte apoptosis by increasing the expression of TRAIL, thus resulting in thyroid follicle destruction.
【Keywords】 iodine; TRAIL; thyroiditis, autoimmune
【摘要】 目的： 观察高碘环境下桥本甲状腺炎大鼠（EAT）TRAIL的表达在发病机制及病理变化中的作用及意义. 方法： 采用雌性SD大鼠制作EAT模型，给予高碘饮食，采用免疫组织化学方法和图像分析，检测高碘环境下EAT大鼠甲状腺TRAIL的表达及分布. 结果： 大鼠甲状腺滤泡细胞中TRAIL的免疫染色阳性率在正常对照组，EAT对照组和EAT高碘组依次增高(P<0.05). 桥本甲状腺炎大鼠中TRAIL免疫染色强阳性甲状腺滤泡细胞多分布于浸润淋巴滤泡附近,浸润淋巴细胞中TRAIL免疫染色较弱. 结论： EAT大鼠TRAIL在甲状腺滤泡细胞中呈有特征性分布的高表达，在高碘环境下，更加显著，提示高碘可能通过引起TRAIL表达的增强诱导甲状腺细胞过度凋亡,致甲状腺滤泡破坏.
【关键词】 碘；TRAIL；甲状腺炎，自身免疫性
0引言
随着全民碘化食盐的逐步强化和普及,我国自身免疫性甲状腺疾病的发病率出现了普遍增加的趋势［1］. 分析国外的流行病学资料和有关的基础研究以及我国现有的能利用的资料可以看出，增加碘摄入量诱发具有遗传倾向人群的自身免疫性甲状腺疾病由隐性转为显性［1］，但其机制尚不明了. 有报道，bcl2家族，Fas与FasL和TRAIL参与了桥本甲状腺炎（hashimotos thyroiditis, HT）中甲状腺细胞凋亡的调控. 目前高碘对Fas, FasL和bcl2表达的影响均有报道［2］，但高碘对桥本甲状腺炎中TRAIL表达途径的影响少见报道. 我们采用免疫组织化学方法和图像分析,检测高碘环境下桥本甲状腺炎大鼠（experimental autoimmune thyroiditis, EAT)甲状腺细胞TRAIL的表达及分布, 观察高碘对EAT的甲状腺结构和病理改变的影响，旨在了解TRAIL在HT发病机制中的作用.
1材料和方法
1.1材料甲状腺球蛋白（pTG）购自Sigma公司；完全弗氏佐剂与不完全弗氏佐剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；兔抗鼠TRAIL多克隆抗体购自SantaCruz公司；免疫组化ABC试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司；DAB购自武汉博士德公司；APES（3氨丙基三乙氧硅烷）处理的切片购自西安宝信生物工程有限公司；雌性SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供.
1.2方法雌性SD大鼠18只，5～6 wk龄，入二级动物饲养室. 随机分组： 正常对照组（6只），普通饲料，普通高压灭菌水喂养；EAT组（12只）： 普通饲料，高碘水(用普通高压灭菌水溶解碘化钾配制成30 mg/L的溶液)［3］喂养，并甲状腺球蛋白（pTG）生理盐水溶至1 g/L与完全弗氏佐剂按V/V=1∶1混合，于实验第15日以每只鼠100 μg乳化的pTG皮内多点注射行初次免疫，pTG与不完全弗氏佐剂按V/V=1∶1混合后于实验第29日加强免疫，以后每周加强免疫1次，共4次，至第4次加强免疫后1 wk取全部大鼠尾血查甲状腺过氧化物酶抗体浓度. EAT组∶正常对照组>8∶1，说明EAT模型制备成功［4］. 再将EAT组随机分为2组，EAT对照组（6只），用普通饲料，普通高压灭菌水喂养；EAT高碘组（6只），用普通饲料，高碘水喂养，2 mo.
将大鼠用乙醚麻醉，取血后，取新鲜甲状腺组织，行冰冻切片，厚约5～6 μm，贴于事先用APES（3氨丙基三乙氧硅烷）处理的切片上，其中正常对照组切片19张，EAT对照组切片25张，EAT高碘组切片30张，37℃烤箱24 h.
ABC技术进行免疫组织化学染色. 按免疫组化ABC试剂盒说明书所示步骤染色. 兔抗鼠TRAIL多克隆抗体工作浓度为1∶400，免疫阳性产物为棕黄色，以正常兔血清及PBS替代一抗染色，作为阴性对照. 密封片号情况下(单盲)，在光学显微镜下对切片染色阳性情况进行半定量评估. 观察全片，如无阳性细胞表达，用“”表示，如阳性细胞表达率＜10%，用“＋”表示，阳性细胞表达率在11%~50%之间，用“”表示，如阳性细胞表达率＞51%用“”表示［5］. 求出每组中“＋”~“”标本所占总例数的百分比为该组标本阳性率，测定各组之间阳性率的差异.
统计学处理： 采用SPSS11.0统计软件，对各组阳性率进行多个样本率比较的χ2分割法检验，P<0.0125表示有统计学意义.
2结果
2.1甲状腺组织形态的观察显微镜下观察,正常对照组甲状腺组织的甲状腺滤泡呈小叶状排列, 滤泡发育成熟,滤泡腔充满胶质,分布均匀,未见炎细胞浸润（图1）. EAT组中大鼠甲状腺与正常对照组比较,均出现不同程度的炎症反应，甲状腺小叶内滤泡不完整, 增生与萎缩滤泡共存，有明显淋巴细胞浸润和炎细胞浸润，EAT高碘组与EAT对照组相比，甲状腺滤泡破坏明显，部分滤泡结构消失（图2）.
2.2TRAIL蛋白免疫组织化学染色Trail蛋白免疫组织化学染色阳性物质呈棕黄色颗粒,位于甲状腺滤泡细胞的胞质及胞膜上（图3）. 正常对照组中TRAIL免疫染色阳性细胞，稀疏散在分布多在小滤泡上，滤泡结构完整，阳性细胞为低柱状. EAT组的甲状腺滤泡细胞TRAIL免疫染色增强，分布不均匀，阳性细胞呈扁平状，强阳性细胞较集中分布在靠近浸润淋巴滤泡附近的小滤泡，部分滤泡已萎缩、破坏. EAT高碘组与EAT对照组相比，TRAIL免疫染色进一步增强，甲状腺滤泡破坏明显，部分滤泡结构消失，无胶质(图4).
正常对照组TRAIL蛋白免疫染色阳性率为11%, EAT对照组为64%, EAT高碘组为96%,EAT高碘组显著高于正常对照组和EAT 对照组(P<0.0125)，EAT对照组较正常对照组TRAIL蛋白免疫染色阳性率亦增高(P<0.0125).
图1正常对照组大鼠甲状腺HE染色×200（略）
图2EAT高碘组大鼠甲状腺HE染色×200（略）
图3甲状腺TRAIL蛋白免疫组织化学染色ABC ×200（略）
图4高碘对EAT大鼠TRAIL分布的影响ABC ×200（略）
3讨论
研究表明,碘与多种甲状腺疾病的发生、与转归密切相关,并在甲状腺细胞的凋亡过程中起重要作用［6］. 随着全民碘化食盐的加强及普及，我国自身免疫性甲状腺疾病发病率有普遍增加的趋势，国外也经历与我国相同的时期.
HT是一种有明确遗传倾向的器官特异性自身免疫病，发病率的增加在遗传易感性基础上与环境因素密切相关，动物实验表明碘是HT发病的主要环境因素之一，适碘和高碘地区的发病率高于低碘区［1］.
我们前期的研究表明在HT中浸润淋巴滤泡附近甲状腺滤泡细胞凋亡明显增加并有Fas和FasL的高表达，而在浸润淋巴细胞中Fas和FasL低表达［7］. 研究发现低浓度碘(10-8 mol/L)对甲状腺细胞Fas表达无明显影响，中、高浓度碘(10-6 mol/L, 10-4 mol/L) 对甲状腺细胞Fas 具有上调作用, Fas表达率显著升高而增加细胞凋亡［2］. 表明高碘环境可通过Fas/FasL凋亡途径影响HT的发生和发展.
TRAIL是与Fas同源的死亡配体，二者介导凋亡的途径并不相同［8］. Bretz等［9］研究表明，细胞因子IFNC, IL1B和TNFA可使正常甲状腺滤泡细胞TRAIL表达上调，TRAIL能直接杀伤正常人原代甲状腺细胞. Ajian等［10］报道，在HT组织标本中，CD8+和CD4+T淋巴细胞表达IFNC, IL1B和TNFA等细胞因子. 因此推测HT的浸润淋巴细胞通过分泌细胞因子,使其附近的甲状腺滤泡细胞表达高水平的TRAIL，从而使甲状腺滤泡细胞发生凋亡. 我们近期研究表明HT中甲状腺滤泡细胞通过自身表达TRAIL, DR4和DR5,以细胞凋亡形式破坏甲状腺滤泡细胞［11］. 本实验显示EAT大鼠甲状腺中浸润淋巴滤泡附近有甲状腺滤泡细胞TRAIL的高表达，浸润淋巴细胞中TRAIL低表达，提示TRAIL途径也参与了HT的发病和病理改变过程,这与我们先前对Fas,FasL在HT的研究结果相似［12］.
本实验中还发现在高碘环境下，EAT大鼠浸润淋巴滤泡附近TRAIL的高表达较对照组进一步增强，浸润淋巴细胞中TRAIL低表达无明显影响，甲状腺滤泡破坏明显，部分滤泡结构消失，无胶质，提示高碘通过使EAT大鼠甲状腺中TRAIL表达增强，促进甲状腺细胞凋亡，以细胞凋亡形式破坏甲状腺滤泡细胞.
通过实验我们可推测在高碘环境下，甲状腺细胞的凋亡,不仅通过FasFasl途径，亦可通过TRAIL表达的增强来实现，进而对其功能造成影响. 因此我们补碘应针对不同人群，对于有自身免疫性疾病史的人群，应适碘饮食，不应盲目补碘，以免加重病情.
【】
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