骨肉瘤中血管内皮生长因子受体KDR的表达及其分析
【关键词】 骨肉瘤
Expression of vascular endothelial growth factor receptor KDR in osteosarcoma and its relationship with microvessel density
【Abstract】 AIM: To explore the expression of vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR) KDR and its relation with microvessel density(MVD). METHODS: CD34 and KDR were investigated in the specimens from 102 osteosarcoma patients. MVD was determined with double blind counting. RESULTS: KDR was strongly expressed in osteosarcoma cells, and weakly expressed in vascular endothelial cells. MVD was significantly different between KDR negative and positive groups (P<0.05). CONCLUSION: High expression of KDR may be related to oeteosarcoma.
【Keywords】 osteosarcoma; endothelial growth factors; receptors, growth factor; endothelium, vascular; microvessel density
【摘要】 目的： 研究骨肉瘤中血管内皮生长因子受体（VEGFR 2）KDR的表达情况，及其与微血管密度（MVD）关系. 方法： 对102例骨肉瘤患者的病理标本应用CD34，KDR对其组织切片分别进行免疫组化染色，双盲计数法进行热点内血管测定MVD. 结果： 骨肉瘤KDR在血管周围的肿瘤细胞质呈较强阳性表达，在部分血管内皮细胞质内表达呈弱阳性，MVD在KDR表达阳性与阴性组中的计数经检验有显著性差异（P<0.05）. 结论： KDR在骨肉瘤细胞的高度表达可能参与骨肉瘤的发病机制.
【关键词】 骨肉瘤；内皮生长因子；受体，生长因子，内皮，血管；微血管密度
0引言
实体肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤间质中血管的新生，许多血管生成因子在肿瘤中均有表达,介导血管新生. 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是其中效力最强的因子之一，它可直接或间接地参与血管新生的每一个过程，可诱导内皮细胞短暂的钙浓度升高、形态改变、细胞分裂及细胞运动，影响内皮细胞的基因表达，降解基底膜，促进血管生成，增加血管的通透性［1］. 目前已证明，KDR是VEGFⅡ型受体，亲和力较高，具有受体型酪氨酸激酶活性，主要表达在内皮细胞. VEGF是通过作用于细胞上的特异性受体而发挥其生物学活性的. 在脑胶质瘤、脑膜瘤和乳腺癌等多种肿瘤组织中KDR的表达上调［2］. 一般认为，KDR可特异性地表达于肿瘤的血管内皮细胞. 因此，我们拟研究KDR在骨肉瘤中的表达情况.
1材料和方法
1.1材料① 标本：199206/200204,本科保存的骨肉瘤的蜡块标本. 标本均经40 g・L-1甲醛溶液固定,常规石蜡包埋，连续切片(厚4 μｍ). 病例共102（男67，女35）例，患者年龄8～42（平均17.8）岁，术前均未接受过化疗或放疗. 肿瘤直径4～25 cm，≥10 cm 57例，<10 cm 45例. ② 试剂：兔抗人KDR蛋白多克隆抗体为美国Santa Craz Biotechnology Inc产品，兔抗人CD34多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司.
1.2方法
1.2.1免疫组化实验测量切片常规脱蜡至水，30 mL・L-1 H2O2 10 min灭活内源性过氧化物酶，微波修复，正常山羊血清封闭，抗体工作浓度为1∶100，滴加KDR多克隆抗体4℃过夜，依次滴加生物素化羊抗兔IgG, SABC. DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片. 以PBS代替第1抗体作为阴性对照，阳性对照采用已知的KDR阳性的标本切片. 胞核或胞质染成棕黄色为阳性.
1.2.2图像分析用多功能真彩色病理分析系统，分别测定肿瘤细胞和血管内皮细胞质表达的平均吸光度值，取其均值作为各自KDR蛋白表达的相对含量.
1.2.3MVD测定按Weidner方法［3］，用低倍镜在肿瘤中心区寻找热点，400倍镜下由2位病理科医师按双盲法分别计数热点内血管. 染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞簇，只要它们和临近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分开，就视为1个微血管，即使是同一血管的头和尾正巧在同一切面上，也计为2个微血管. 结果以单个400倍视野下最多的血管数目表示.
统计学处理：数据用SPSS 11.0统计软件进行分析，组间比较用Wilcoxon检验.
2结果
2.1骨肉瘤组织中KDR的表达及图像分析在102例骨肉瘤标本中，KDR表达阳性78例，阳性率为76%. 骨肉瘤KDR在血管周围的肿瘤细胞质呈较强阳性表达，在部分血管内皮细胞质内表达呈弱阳性（Fig 1）. 图像分析结果：肿瘤细胞表达灰度值为176±13，血管内皮细胞表达灰度值为156±9. 经比较有显著统计学意义（P<0.05），显示KDR在肿瘤细胞与血管内皮细胞中的表达有差异.
图1KDR在骨肉瘤细胞质中显色阳性 (略)
2.2骨肉瘤组织中的微血管密度骨肉瘤组织的毛细血管、小静脉和小动脉的CD34染色阳性，高表达区多出现在肿瘤的边缘. 102例骨肉瘤标本在400倍下MVD计数结果为42±6 (3～63) .
2.3骨肉瘤组织中KDR与MVD表达的关系在78例KDR表达阳性组中，MVD计数为46±9；24例KDR表达阴性组中，MVD计数为37±4，两组之间有显著性差异(P<0.05)，说明KDR表达与肿瘤血管密度相关.
3讨论
KDR是VEGF主要受体之一，酪氨酸激酶第Ⅲ亚型, 胞外含7个免疫球蛋白区域. 有报道表明，KDR胞外Ig样domain2属VEGF结合区，而domain1和domain3对受体与配基的结合起一定作用，domain4能维持受体的二聚体化. 目前已经公认，VEGF对内皮细胞的增殖、分化作用是由KDR介导的. KDR介导的信号转导的主要过程是：VEGF结合到KDR胞外区的Ig结构域上，引起KDR胞内激酶区特定酪氨酸残基的交叉磷酸化而活化. 活化的受体进而被含有SH2结构域的适配分子（adaptor）如Grb2等结合，通过一系列生化级联反应，活化MAPK. MAPK作为转录因子可转运至细胞核内，启动特定基因的表达，完成VEGF相应的促增殖作用［4］. 在脑胶质瘤、脑膜瘤和乳腺癌等多种肿瘤组织中KDR的表达上调. 一般认为，KDR可特异性地表达于肿瘤的血管内皮细胞.
本实验结果证实KDR可在骨肉瘤组织中血管周围的肿瘤细胞质呈较强阳性表达，在部分血管内皮细胞质内表达呈弱阳性，这与以往VEGF在骨肉瘤组织中表达情况的研究基本一致［5］. VEGF可诱导内皮细胞分裂及细胞运动，影响内皮细胞的基因表达，降解基底膜，促进血管生成，增加血管的通透性，是骨肉瘤迅速生长、转移，恶性度高的机制之一. 本结果提示KDR则是VEGF在骨肉瘤形成中的重要步骤. KDR在肿瘤细胞中的表达显著强于血管内皮细胞，提示除了诱导血管形成外，可能还具有其他作用，尚需进一步实验验证.
此外，KDR表达阳性组的MVD明显高于VEGF表达阴性组，两者之间有显著性差异. KDR表达阳性者，其MVD值也高，显示两者成正相关. 这提示VEGF可能通过KDR促进肿瘤血管生长，增加血管通透性，影响骨肉瘤的生物学特性. 同时，MVD已经实验证实与骨肉瘤的恶性程度有关，并作为骨肉瘤预后的指标［6,7］. KDR与MVD表达的平行性，提示KDR也可对判定骨肉瘤的预后提供.
肿瘤细胞和血管是密切相关的系统，内皮细胞可能由来自肿瘤细胞所发出的信号激发，从休眠期转至快速生长期，血管大量生成，为肿瘤细胞的生成、转移提供物质基础和途径. 当对肿瘤的血管生成抑制时，肿瘤的生长受到抑制，肿瘤的转移机会也随之降低，从而达到肿瘤、提高患者生存率的目的. 因此，通过抑制KDR的表达来降低VEGF的作用，抑制肿瘤血管增殖，也为临床治疗骨肉瘤提供了思路.
【参考】
［1］ Ferrara N, Gerber HP. The role of vascular endothelial growth factor in angiogenesis ［J］. Acta Haematol, 2001;106(4):148-156.
［2］ Fakhari M, Pullirsch D, Abraham D. Selective upregulation of vascular endothelial growth factor receptors neuropilin1 and 2 in human neuroblastoma ［J］. Cancer, 2002;94(1):258-263.
［3］ Amo Y, Masuzawa M, Katsuoka K. Expression of vascular endothelial growth factor in a human hemangiosarcoma cell line (ISOHAS) ［J］. Arch Dermatol Res, 2001;293(6):296-301.
［4］ Kaya M, Wada T, Kawaguchi S. Increased pretherapeutic serum vascular endothelial growth factor in patients with early clinical relapse of osteosarcoma ［J］. Br J Cancer, 2002;86(6):864-869.
［5］ Aoki Y, Tosato G. Vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in the pathogenesis of primary effusion lymphomas ［J］. Leuk Lymphoma, 2001;41(34):229-237.
［6］ Stopeck A, Sheldon M, Vahedian M, Hannah A. Results of a phase I doseescalating study of the antiangiogenic agent, SU5416, in patients with advanced malignancies ［J］. Clin Cancer Res, 2002;8(9):2798-2805.
［7］ Szary J, Kalita K, Szala S. KDR promoter can transcriptionally target cytosine deaminase suicide gene to cancer cells of nonendothelial origin ［J］. Anticancer Res, 2001;21(5):3471-3475.
