大肠癌中VHL mRNA，FIH

               作者：杨晓军,高鹏,车团结,黄海云 

【关键词】  结直肠肿瘤；低氧诱导因子1α；VHL基因；缺氧诱导因子抑制因子1

     　Effect of VHL mRNA and FIH1 mRNA expressions in colorectal carcinoma on HIF1α protein level

    【Abstract】 AIM: To detect mRNA expressions of VHL and FIH1 in colorectal cancer, and explore their effect on HIF1α protein level. METHODS: Semiquantitative RTPCR assay was used to detect the expressions of VHL mRNA, FIH1 mRNA in 42 patients with colorectal cancer; Expression of HIF1α protein was measured by SP immunohistochemistry; Spearman rank correlation was used to analyze the correlation between them. RESULTS: mRNA levels of VHL and FIH1 in colorectal cancer were significantly lower than those in adjacent tissue （t=-10.14, P=0.00；t=-15.26, P=0.00）； Both expressions decreased as Dukes stage increased, and the expressions in Dukes A+B stage were significantly higher than those in Dukes C+D stage （t=2.84, P=0.01； t=-5.13, P=0.00）； Their expressions had no relationship with tumor location and gender. In 42 cases of colorectal cancer, positive rate of HIF1α protein was 69.1% (29/42), the expression in Dukes C+D stage (80.0%, 24/30) was significantly higher than that in Dukes A+B stage (41.7%,5/12), (t=5.89,P=0.02); it was negative in adjacent tissue; Spearman rank correlation displayed that the expressions of VHL mRNA and FIH1 mRNA were negatively correlated with the HIF1α protein level (rs=-0.97, P=0.01; rs=-0.66, P=0.01). CONCLUSION: The overexpression of HIF1α may play an important role in the development and matastasis of colorectal cancer； The decrease of VHL mRNA and FIH1 mRNA expressions is closely correlated with the increase of HIF1α protein level in colorectal cancer.

    【Keywords】 colorectal neoplasms;   HIF1α;  VHL;  FIH1

    【摘要】 目的： 检测大肠癌中VHL mRNA，FIH1 mRNA以及HIF1α蛋白的表达,探讨VHL，FIH1对HIF1α蛋白水平的影响. 方法：采用RTPCR技术检测42例大肠癌组织和相应的癌旁正常粘膜组织中VHL mRNA，FIH1 mRNA的表达，采用免疫组化SP法检测HIF1α蛋白在大肠癌和癌旁正常组织中的表达，Spearman相关关系检验分析其之间的相关性. 结果：大肠癌组织VHL mRNA和FIH1 mRNA的表达水平显著低于癌旁正常组织（t=-10.14,P=0.00；t=-15.26,P=0.00）；二者的表达水平随Dukes分期而降低，DukesA+B期显著高于DukesC+D期（t=2.84,P=0.01；t=-5.13,P=0.00）；它们的表达水平与与肿瘤部位、性别无关. 大肠癌组织HIF1α蛋白表达阳性率为69.1%(29/42),在癌旁正常组织中均为阴性；DukesC+D期(80.0%,24/30)显著高于Dukes A+B期(41.7%,5/12),(t=5.89, P=0.02)； Spearman相关分析显示，HIF1α表达水平与VHL mRNA，FIH1 mRNA的表达水平显著负相关（rs=-0.97,P=0.01，rs=-0.66,P=0.01）. 结论：HIF1α的过表达在大肠癌的发生、浸润转移过程中起着重要作用，大肠癌组织中VHL以及FIH1的水平下降与HIF1α蛋白水平的升高之间存在密切相关.

    【关键词】 结直肠肿瘤；低氧诱导因子1α；VHL基因；缺氧诱导因子抑制因子1

     低氧诱导因子1（hypoxia inducible factor1，HIF1）在低氧状态下通过对靶基因的转录激活，调控着血管发生、红细胞生成以及糖酵解等过程［1］. 希佩尔林道病(von HippelLindau, VHL)希佩尔林道病肿瘤抑制蛋白(protein von HippelLindau, pVHL)在依赖于氧的条件下作用于HIF1的α亚单位，促使其发生泛素化和蛋白酶体的降解［2］. 低氧诱导因子1抑制因子(factor inhibiting HIF1, FIH1)能结合HIF1α并抑制其转录激活功能 ［3］. 我们采用RTPCR法检测了大肠癌组织和相应癌旁正常组织中VHL mRNA,FIH1 mRNA的表达水平，同时采用免疫组化方法检测HIF1α蛋白的表达，并进一步分析探讨它们之间的相关性.

    1材料和方法

    1．1材料甘肃省人民肛肠科200410/200504手术切除并经病理证实的新鲜大肠腺癌标本42(男27，女15)例，年龄31～76（中位56)岁. 其中结肠癌7例，直肠癌35例. Dukes A期5例，B期7例，C期18例，D期12例(有7例发生转移), 术前未做化放疗. 同时距肿瘤边缘5～10 cm以上切取正常组织作为自身对照. 标本离体后5 min内即投入液氮罐并转至-80℃冰箱冻存. RNA提取试剂,饱和酚,100 bp DNA ladder购自上海生工; 逆转录酶MMLV(RNase H)，Taq酶，Agarose Gel，MMLV Rtase cDNA synthesis Kit(code D6130)，RNA酶抑制剂，琼脂糖（Agarose）均购自大连宝生物公司; 兔抗人HIF1α多克隆抗体购自武汉博士德公司;生物素链霉素抗生物素蛋白检测系统(SP)试剂盒均购自福州迈新公司; 根据从NCBI的Nucleotide数据库中所查到VHL和FIH1 mRNA序列，经机辅助设计引物，内参对照选用磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh). 引物均由上海生工合成，使用浓度均50 μmol/L(表1).

    1．2方法

    1．2.1VHL及FIH1的RTPCR检测从-80℃冰箱中取出冻存的新鲜组织(癌及癌旁正常组织) 200 mg，采用Trizol法提取组织总RNA，测定总RNA浓度及纯度. 使用Takara的MMLV Rtase cDNA synthesis Kit(codeD6130)反转录合成cDNA的第1链，接着合成第2链（均照说明书操作）. 将所得30 μL产物冻存于-20℃以备进行PCR. PCR反应体系50 μL，包括10×Buffer 5 μL, 25 mmol dNTP mixture 0.5 μL,Taq DNA酶1 μL，目的引物（VHL或FIH1）上下游各1 μL，Gapdh引物上下游各1 μL，cDNA模板1 μL，无菌水38.5 μL. 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s,退火30 s(退火温度VHL 55℃,FIH1 58℃)，72℃延伸45 s，30个循环；72℃ 10 min后终止反应. PCR产物于20 g/L的琼脂糖凝胶做电泳,以无菌水代替cDNA模板的PCR管为阴性对照，天能凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析. VHL mRNA,FIHmRNA相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参对照Gapdh电泳条带密度指数的比值来表示.

    1.2.2HIF1α免疫组化染色取出冻存的新鲜标本迅速置于40 g/L甲醛中固定，制成石蜡块. 先行HE染色确定,取标本无出血、坏死区域,组织厚度5 μｍ连续切片,HIF1α稀释度1∶50,SP法染色，用PBS液代替一抗作阴性对照. DAB作底物显色,苏木素复染核,梯度酒精脱水,二甲苯透明,树脂胶封片,显微镜下观察. HIF1α判断标准按［4］:阳性细胞胞核呈棕黄色颗粒着色,阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数<5%；阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数的范围为5%～25%；阳性()为肿瘤组织阳性细胞数的范围为>25%～50%；阳性()为肿瘤组织阳性细胞数>50%.

    统计学处理:数据采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用t检验. 计数资料两组率的比较采用四格表的校正卡方检验，RTPCR结果和免疫组化结果的相关性采用Spearman等级相关分析，按α=0.05的水准判断是否具有统计学意义.

    2结果

    2．1RTPCRVHL mRNA在大肠癌组织中的表达水平为0.51±0.08，癌旁正常组织中的表达水平为0.63±0.11，配对t检验结果显示差异有显著性（t=-10.14,P=0.00）；FIH1 mRNA在大肠癌组织中的表达水平为0.52±0.05，癌旁正常组织中的表达水平为0.60±0.14，配对t检验结果显示差异有显著性（t=-15.26,P=0.00）. VHL mRNA，FIH1 mRNA表达水平与发病部位，性别，Dukes分期以及有无转移等临床病理资料之间有关(图1,2,表2).表2大肠癌组织VHL mRNA与FIH1 mRNA的表达与临床病理的关系

    2．2免疫组化染色癌旁正常组织HIF1α免疫组化染色均为阴性（图3）；癌组织中29例（69.1%）HIF1α阳性(图4)，其中(+)16例，()10例，()3例. HIF1α表达与Dukes分期明显相关，DukesA+B期和DukesC+D期的阳性率分别为41.7%(5/12), 80.0%(24/30),两者差异具有显著性(P<0.05). 无转移者HIF1α阳性率为65.7%(23/35),有转移者阳性率为85.7%(6/7),两者差异无统计学意义.

    2．3VHL mRNA，FIH1 mRNA表达与HIF1α蛋白水平的关系我们采用非参数检验的Spearman等级相关分析，结果显示，大肠癌组织中HIF1α表达水平与VHL mRNA和FIH1 mRNA的表达水平呈显著负相关(rs=-0.97,P<0.01；rs=-0.66,P<0.01).图3癌旁正常组织HIF1α的表达SP ×400

    3讨论

    HIF1是一个异二聚体，由对氧敏感的α亚单位(HIF1α或HIF2α)和组成性表达的β亚单位(HIF1β,也称之为芳香烃受体核转位分子，ARNT)构成［5］. HIF1调节通路的失调对于癌症以及缺血性疾病的发生有着重要的影响作用［6］. VHL基因定位于染色体3p2526区域,包含3个外显子，编码由284个氨基酸残基组成的pVHL［7］. FHI1基因定位于染色体10q24，它在生物工程信息数据库国家中心的基因座ID为55662. 此基因有8个外显子，全长14 kb，可以编码一种特异性的天冬酰胺羟化酶，属于2酮戊二酸依赖性双加氧酶家族［8］. 我们用RTPCR法检测了大肠癌和癌旁正常组织中VHL mRNA和FIH1 mRNA的水平，同时用免疫组化法检测了HIF1α蛋白在癌组织和癌旁正常组织中的表达. 结果表明，VHL mRNA和FIH1 mRNA在癌组织中的表达水平显著低于癌旁正常组织；二者的表达水平随Dukes分期而降低，Dukes A+B期显著高于Dukes C+D期；FIH1 mRNA在有转移的病例中显著低于无转移的病例；它们的表达水平与与肿瘤部位、性别无关. 而HIF1α蛋白表达在癌组织中总阳性率为69.1%(29/42),在癌旁正常组织中均为阴性；在Dukes C+D期显著高于Dukes A+B期；HIF1α蛋白的表达在转移的病例中高达85.7%(6/7)，而未转移者为68.6%(23/35)，但却无统计学意义，可能是样本量过少的缘故.

    Spearman等级相关分析显示，HIF1α表达水平与VHL mRNA，FIH1 mRNA的表达水平显著负相关， 这表明大肠癌组织中抑癌基因VHL以及FIH1的水平下降与HIF1α蛋白水平的升高之间存在密切相关. HIF1α的过表达在大肠癌的发生发展，浸润转移过程中起着重要作用，HIF1α高表达的癌组织具有较强的浸润和转移能力. 提示HIF1α的表达可反映结直肠癌的生物学行为，可以作为判断结直肠癌浸润、转移和预后的有价值指标. 此外，低氧适应性反应在肿瘤发生发展中起着重要作用，而HIF1α是此过程中的枢纽环节，利用反义核酸抑制HIF1α的转录活性已经成为肿瘤的一个重要切入点［9-11］，随着对VHL和FIH1作为HIF1α负性调节子功能的逐步阐明［12］，进一步探讨联合应用VHL基因治疗和FIH1的拟似物，以降低HIF1α的表达和转录活性，抑制癌细胞的低氧适应反应，在防治大肠癌的发生发展，浸润转移方面将会有更广阔的前景.

    【】

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