靶向血管紧张素Ⅱ受体基因的短发夹RNA的功能比较
作者：邱龄，肖传实，曾秋棠，李茂莲
【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体
Gene silencing targeted to the rat AT1 receptors by efficient shRNAs and its screening
【Abstract】 AIM: To investigate the efficacy of short hairpin RNAs (shRNAs) to modulate the expression of rat angiotensin Ⅱ type1 (AT1) receptor gene in mammalian cells and to explore the correlations between the features of efficient shRNAs and shRNAs functionality. METHODS: We generated 4 shRNAs expression vectors targeting against rat angiotensinⅡ receptors. The shRNAs were targeted to 4 different regions of the same gene. The rat C6 glioma cells were transfected with constructed pGenesil1shRNA plasmid and scrambled plasmid. The cultured cells were collected at different phases for RTPCR and Western blot analyses. RESULTS: 24 h later, no significant reduction in AT1 mRNA levels at all treated groups could be detected. 48 h later, AT1 mRNA level of Pb treated group droped to (55.7±7.6)% of that in control group, and reached their lowest point after 72 h (43.7±8.2)%. No significant inhibition of AT1 receptor mRNA expression was found in other groups (P＞0.05). The AT1 mRNA and protein levels behaved ultimately similarly. At hour 24 and 48, the AT1 protein was (46.9±4.2)% and (37.0±3.7)% respectively compared to control and a maximum reduction was observed after 72 h incubation ［(28.1±4.0% compared to controls)］. CONCLUSION: Besides some general rules, we believe that the loop structure in the mRNA at the region targeted by siRNA and the better accessibility of the siRNA to targeted mRNA do have a strong effect on silencing.
【Keywords】 RNAi; hypertension; angiotensinⅡreceptor; vector
【摘要】 目的：研究哺乳动物细胞中shRNA调节大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体基因表达的有效性并探索有效shRNA的特征与shRNA功能性之间的关系. 方法：设计并构建四个靶向大鼠AT1受体基因不同区域的shRNA表达载体，转染大鼠神经胶质瘤C6细胞，并在不同时相收集转染的细胞，进行RTPCR和Western blot检测. 结果：转染24 h之后，各处理组均未见AT1 mRNA水平有明显减少. 与对照组相比，Pb组在转染后48 h血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因水平下降到（55.7±7.6）%，72 h后达到最低点（43.7±8.2）%. 其它组AT1受体mRNA表达无明显抑制(P＞0.05). 抑制大鼠血管紧张素Ⅱ受体mRNA基因及其蛋白的结果类似. 与对照组相比，Pb组血管紧张素Ⅱ受体蛋白在24 h和48 h分别减少至（46.9±4.2）% 和（37.0±3.7）%，最大减少在转染后72 h （28.1±4.0）%. 结论：选择有效的shRNA序列时，除了一般的原则之外，靶位mRNA的环状结构及siRNA是否能到达靶位对基因干扰实验能否成功具有重要作用.
【关键词】 RNA干扰；高血压；血管紧张素Ⅱ受体；载体
基因干扰（RNA interference）可以特异性地靶向降解目的基因mRNA，从而使组织或细胞中的靶基因表达减少或沉默［1］. 在本实验中，我们采用RNAi技术，拟靶向降解大鼠神经胶质瘤C6细胞中的血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1R）的mRNA，选取并合成了多条编码大鼠AT1R mRNA的短发夹RNA（shRNA）的核苷酸单链，退火形成双链结构并将其克隆进入质粒载体，在构建完成四条编码AT1R shRNA的表达载体之后，转染C6细胞. 根据不同核苷酸序列shRNA质粒在哺乳动物细胞内的功能表达，研究核苷酸序列及碱基不同的shRNA其靶向沉默大鼠AT1R的作用差别，探索筛选有效shRNA的原则.
1材料和方法
1．1材料载体pGenesil1质粒购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司，限制性核酸内切酶BamHⅠ，HindⅢ，SalⅠ，PstⅠ购自大连宝生物工程有限公司; T4 DNA连接酶及缓冲液购自New England Biolabs公司; 大鼠神经胶质瘤细胞株C6细胞购自典型物保藏中心; 细胞培养液DMEM购自Hyclone公司; 转染试剂Metafectamine购自德国Biotex公司. 所有的DNA合成及引物合成服务均由上海博亚生物技术有限公司提供.
1．2方法
1．2．1靶基因AT1R mRNA的shRNA的构建在GenBank上选取大鼠AT1R的基因序列（序列号NM_030985），利用网上设计软件siRNA Target Finder，选取siRNA以碱基TT结尾、长度为21个核苷酸的序列，并且GC含量最大不超过60%，剔除含有连续四个或四个以上的A或T碱基的核苷序列，并通过BLAST验证的靶基因核苷酸序列四条，化学合成编码shRNA序列的DNA前向和反向序列单链如下：靶基因核苷酸序列同时设计一对非特异性序列作为阳性对照. 将合成的shRNA序列退火，与线性化的pGenesil1质粒连接，转化并提阳性克隆，PstⅠ和SalⅠ酶切和测序鉴定证实.以上不同的靶基因序列质粒分别称为pGenesilA（Pa），pGenesilB（Pb），pGenesilC（Pc）和pGenesilD（Pd）质粒.
1．2．2细胞培养及转染按2×108/L密度以相同的细胞数接种培养板，过夜至细胞铺满50%～60%. 用Metafectamine转染细胞，按1∶6的比例，根据试剂提供商的转染方案进行转染.
1．2．3RTPCRAT1基因引物序列为：5′TGTTCCCTTTCCTTATCATTCT3′, 5′CTTTGCTTGGTTACT
CCTTCA3′，内参GAPDH的引物序列为：5′TTCAACGGCACAGTCAAGG3′, 5′TTAGTGGGGTCT
CGCTCC3′. 反应体积25 μL包括5 μL cDNA，各引物0.25 μL，1.5 μL MgCl2，0.25 μL Taq DNA聚合酶，0.5 μL dNTP混合物和5 μL 10×缓冲液. 反应条件: 在94℃退火3 min之后，94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 15 s进行30个循环. 毕后，产物上琼脂糖凝胶电泳.
1．2．4Western Blot分析转染pGensilAT1shRNA质粒和对照质粒之后，不同时相收获C6细胞. PBS液洗涤后，上样缓冲液溶解细胞. 煮沸溶解液10 min后，离心，取上清，弃沉淀物. 确定蛋白浓度. 电泳分离细胞溶解液，转膜. 50 g/L脱脂奶封闭后，加入抗AT1抗体（1∶1000）和抗βactin抗体（1∶1500）室温下孵育1.5 h，再加入二抗（抗兔HRP抗体）孵育，增强型化学发光显色.
统计学处理：根据RTPCR和Western Blot分析结果，用图像处理软件ImageTool 3.0测灰度值，并与内参照相比得相对值. 用SPSS 11.5统计软件oneway ANOVA进行组间方差分析. 显著性水平为P＜0.05.
2结果
2．1不同shRNA表达质粒靶点及二级结构我们选择大鼠血管紧张素Ⅱ受体基因mRNA序列的部分序列,即556~575 bp，469~488 bp，595~614 bp， 663~682 bp,做为基因沉默靶位（图1）. 构建了四条碱基序列不同的pGenesilAT1shRNA质粒，预计产生的短发夹RNA如图2所示.
除在3′端缺乏两个连续的胸苷之外，AT1shRNA的正义链与大鼠AT1基因的mRNA序列的靶位基因序列是相同，反义链与靶序列互补. 其转录产生的RNA，预计可以折叠成短发夹siRNA. 所转录出的shRNA在理论上应可裂解靶基因mRNA，而经重新洗牌的对照质粒所转录出的shRNA则不应对AT1受体基因产生有效的基因沉默效应.
2．2AT1shRNA转染后AT1 mRNA水平和蛋白表达转染四组阳性质粒24 h后，各组AT1 mRNA水平无明显减少. 在48 h后与对照组相比，转染Pb质粒组的AT1 mRNA表达水平下降到（55.7±7.6）%，72 h下降到最低点［仅为对照组的（43.7±8.2）%］. 转染重新洗牌的siRNA大鼠神经胶质瘤C6细胞其AT1受体mRNA表达水平无明显抑制(P>0.05). 结果提示，Pb质粒明显抑制了AT1受体mRNA基因的表达，其它三组质粒抑制AT1受体mRNA基因作用不显著（图3，4）. 将抑制AT1受体mRNA有效的Pb质粒进行Western Blot分析. 在24 h和48 h，AT1蛋白的表达分别为（46.9±4.2）% 和（37.0±3.7）%. 与对照组相比，表达减少的最大时相在转染后的72 h［仅为对照组的（28.1±4.0）%］. 结果表明，Pb质粒转染的细胞，AT1蛋白水平下降. 而转染重新洗牌的shRNA质粒和对照组则并不能减少AT1基因的表达（图5）. 所有的结果清楚表明，转染Pb质粒能够抑制AT1基因的表达.
3讨论
肾素血管紧张素系统其主要的效应分子血管紧张素Ⅱ具有调节血压、水钠平衡、神经功能等作用. 研究证实，血管紧张素Ⅱ参与了动脉硬化、心肌梗塞、血管和心肌重塑以及充血性心力衰竭的病理生理过程. 血管紧张素Ⅱ通过直接激活AT1R并间接刺激一些生长因子和细胞因子的释放，诱导心肌细胞,血管细胞肥厚和增生［2］. 同时也可刺激AT2，激活与AT1相反的生物学效应而导致血管扩张、缓激肽生成增加、抑制纤维化和血管重塑［3］. 本研究构建AT1短发夹RNA表达质粒，试图用基因沉默技术抑制哺乳动物细胞的AT1 mRNA的表达，希望在阻滞AT1受体之后，通过血管紧张素Ⅱ对AT2的作用，达到血管扩张，降低血压、抑制血管重塑等目的［4］.
实验结果表明，我们观测到AT1基因mRNA的表达在早期即有减少，而随着mRNA水平的抑制，相应的蛋白也有所减少. 结果表明，U6启动子驱动的shRNA序列可有效地和特异地抑制AT1基因在转染的C6细胞中的表达. 因此，通过shRNA的表达，在细胞中抑制与高血压病理生理相关的AT1基因的表达，有可能成为一种有效的方法.
目前尚无选择siRNA序列的共识性意见或标准［5］. 为了优化siRNA诱导的基因沉默效率，许多研究小组对寡核苷酸长度、二级结构及siRNA双链的序列特异性进行了研究. 普遍认为［6］，siRNA序列应在靶基因起始密码子下游100个碱基之后进行选择，应避开起始密码子的5′或3′端非编码区选择siRNA序列. 选择的正义链序列应是AA（N19）TT，其中N代表任何核苷酸，即选择的siRNA应该有两个尿嘧啶核苷的3′突出末端. 并且所选的siRNA的长度应是21个核苷酸. 决定RNA干扰研究成功与否的因素还有很多，包括靶位在mRNA三级结构中的位置、转染效率以及双链shRNA的特异性等［7-8］. 在比较本实验中设计的四条质粒时我们注意到，其中Pc和Pd的靶向裂解部位均位于靶基因mRNA二级结构中的核心位置尤其以Pd明显，这可能是质粒转染细胞后转录产生的短发夹RNA在与RISC (RNA诱导的基因沉默复合物)结合后无法进入靶mRNA裂解部位而导致实验失败的原因之一. 而Pa和Pb的靶向裂解部位位于靶基因mRNA二级结构中的表面位置，但质粒Pa也无效，分析可能的原因：①质粒Pa的GC含量偏低可以导致对靶基因mRNA的识别效率的减少; ②与RISC杂交效率的下降. 除此之外，我们还发现Pb质粒裂解靶基因的局部二级结构比质粒Pa裂解的部位更松散一些，也就是前者靶位中的氢键相对弱于后者的靶位. 在这些影响因素中，我们认为最重要的因素是siRNA能否进入靶位，而靶位中mRNA的结构是否足够松散，允许siRNA与RISC复合体进行靶向裂解.
总之，在进行短发夹RNA设计时，除了要遵循如靶序列应位于开放阅读框，而不能选择非编码区；GC含量应在50%左右；避开起始密码子后至少100个碱基；搜索5′AA（N19）序列并进行BLAST等一些普遍的规则［9］之外，我们认为siRNA能否进入靶裂解部位并且靶位的二级结构是否松散是有效shRNA合理设计并取得实验成功的最重要的因素.
【】
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