椒目油对豚鼠哮喘模型肥大细胞和类胰蛋白酶的影响

              作者：谢柏梅，戚好文，赵睿，林小萍    

【关键词】  椒目油；哮喘；肥大细胞；类胰蛋白酶

     　　Effects of zanthoxylum seed oil on mast cells and tryptase of asthmatic models in guinea pigs

    【Abstract】 AIM: To explore the effects of zanthoxylum seed oil （ZSO） on mast cells in lung tissue and tryptase in plasma of asthmatic models in guinea pigs and to provide theoretical basis for the treatment of asthma by using ZSO. METHODS: This experiment included 4 groups: normal control group, asthmatic model group, dexamethasone treatment group and ZSO treatment group, 9 guinea pigs involved in each group. Asthmatic models in guinea pigs were constructed by immunization of intraperitoneal injection with ovalbumin (OVA) and challenge of inspiration with nebulized OVA. Mast cells were observed under a microscope and tryptase levels were measured by antibody against tryptase with UniCAP100 system. RESULTS: The numbers of mast cells and the percentage of degranulation of mast cells in lung tissue and the plasma levels of tryptase of asthmatic model group in guinea pigs ［（14.87±4.67）,（42.85±5.99）％ and （119.78±12.50）］ were significantly higher than those of normal control group ［（2.38±0.52）,（24.91±9.79）％ and （88.78±4.74）］ (P<0.01). While the above indices in the ZSO group ［（6.38±1.06）,（25.44±8.21）％ and （93.22±6.40）］ and dexamethasone group［（6.63±1.41）,（25.33±6.14）％ and （92.10±7.11）］ were significantly lower than those of the asthmatic model group (P<0.01). There was no statistically significant difference in the above indices between ZSO group and dexamethasone group （P＞0.05）. CONCLUSION: ZSO could efficiently decrease the numbers of mast cells and the percentage of degranulation of mast cells in lung tissue and the plasma levels of tryptase of asthmatic guinea pigs, so that it could effectively treat asthma.

    【Keywords】 zanthoxylum seed oil；asthma；mast cell；tryptase

    【摘要】 目的：探讨椒目油（ZSO）对豚鼠哮喘模型肺组织中肥大细胞及血浆类胰蛋白酶的影响，为ZSO哮喘提供理论依据. 方法：实验分为4组：对照组，哮喘模型组，地塞米松治疗组和ZSO治疗组. 用卵白蛋白(OVA)腹腔注射致敏和雾化吸入激发建立哮喘豚鼠模型. 镜下观察肺组织肥大细胞数量及脱颗粒现象. 运用UniCAP100全自动体外变应原检测仪测定豚鼠血浆类胰蛋白酶含量. 结果：哮喘模型组豚鼠肺高倍视野肥大细胞数、脱颗粒百分率及血浆类胰蛋白酶含量分别为（14.87±4.67）,（42.85±5.99）,（119.78±12.50），与对照组（2.38±0.52）,（24.91±9.79）,（88.78±4.74）相比均升高，差异有统计学意义(P＜0.01). ZSO治疗组豚鼠肺高倍视野肥大细胞数、脱颗粒百分率及血浆类胰蛋白酶含量分别为（6.38±1.06）,（25.44±8.21）,（93.22±6.40）,与地塞米松治疗组豚鼠肺高倍视野肥大细胞数、脱颗粒百分率及血浆类胰蛋白酶含量分别为（6.63±1.41）,（25.33±6.14）,（92.10±7.11）,与哮喘模型组相比显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01). ZSO与地塞米松两治疗组之间上述指标相比差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论：ZSO能有效地减少哮喘豚鼠肺肥大细胞数量，抑制肥大细胞脱颗粒、释放类胰蛋白酶，从而能有效地治疗哮喘.

    【关键词】 椒目油；哮喘；肥大细胞；类胰蛋白酶

    支气管哮喘是一种复杂的慢性呼吸道炎症，哮喘患者气道平滑肌可见大量肥大细胞浸润并呈脱颗粒状态［1］. 肥大细胞特有的类胰蛋白酶是肥大细胞脱颗粒的标志物，具有增高气道反应性、促进炎症细胞聚集及刺激多种细胞增殖［2］的作用，已成为哮喘研究的一大热点. 中药椒目治疗哮喘悠久，疗效显著，但其作用机制尚不清楚. 我们通过探究椒目油（zanthoxylum seed oil, ZSO）对豚鼠哮喘模型肥大细胞及其所释放的类胰蛋白酶的作用，揭示椒目治疗哮喘的作用机制，为ZSO的临床应用提供理论依据.

    1材料和方法

    1.1材料健康雄性豚鼠36只，体质量(250±50) g购于第四军医大学实验动物中心；ZSO由第四军医大学西京药剂科提供（批号：20050221）；卵白蛋白（ovum albumin，OVA）购于美国Sigma公司；401AI超声雾化器购于上海鱼跃医疗设备有限公司；UniCAP100全自动体外变应原检测仪为瑞典PHARMACIA公司产品；UniCAP Tryptase试剂盒购于瑞典PHARMACIA公司.

    1.2方法

    1.2.1豚鼠哮喘模型的建立按参照［3］的方法操作. 即豚鼠腹腔注射含有100 g/L OVA及100 g/L氢氧化铝凝胶的生理盐水1 mL致敏，第15日用10 g/L OVA溶液超声雾化激发，每日1次，连续7 d. 每次激发直到豚鼠出现咳嗽、呼吸急促，腹肌紧张等哮喘症状为止.

    1.2.2实验分组及处理将豚鼠随机分为4组：对照组、哮喘模型组、地塞米松治疗组和ZSO治疗组，每组9只. 对照组用等量生理盐水注射和雾化吸入; 哮喘模型组用OVA致敏激发; 地塞米松治疗组致敏激发方法同哮喘模型组，但激发后立即给予5 g/L地塞米松溶液雾化吸入5 min; ZSO治疗组致敏方法同哮喘模型组，激发后立即给予ZSO以3 mL/kg灌胃.

    1.2.3类胰蛋白酶测定各组豚鼠末次激发后，从心脏直接抽血5 mL，立刻置入含EDTA的抗凝管中混匀，静置30 min后以1500 r/min离心10 min，留取血浆冻存于-80℃. 运用UniCAP100全自动体外变应原检测仪及UniCAP Tryptase试剂盒测定血浆中类胰蛋白酶的含量.

    1.2.4细胞形态学观察放血处死动物，取右肺下叶相同部位组织石蜡包埋切片，行HE和Giemsa染色［4］. Giemsa染色后于低倍镜下选择特殊染色阳性的细胞相对密集区，计数9个高倍视野中的肥大细胞总数，每个高倍视野中的平均细胞数. 计算肥大细胞脱颗粒百分率.

    统计学处理：所有数据均以x±s表示. 将原始数据输入SPSS 11.0统计软件包，方差齐同，组间比较运用LSDt检验；方差不齐，采用非参数方法进行组间比较.

    2结果

    2.1模型动物大体表现哮喘模型组豚鼠在诱喘过程中出现哮喘发作症状，不同程度地表现为咳嗽、呼吸急促、腹肌紧张、四肢软瘫、行动迟缓或抽搐跌倒，约30 min后症状逐渐缓解. ZSO组和地塞米松治疗组豚鼠激发后所表现症状的程度较同期哮喘模型组明显减弱，约5～10 min后症状缓解或消失.

    2.2HE染色病表现哮喘模型组豚鼠肺外观体积增大，表面略肿胀，有不规则暗红色充血区及多处小米粒大小的红色出血点，支气管和肺泡腔内黏液分泌明显增多. 其肺组织病理切片HE染色显示：支气管壁及支气管周围组织有多处红细胞聚集区，且有大量炎细胞浸润，包括淋巴细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞等；气道黏膜上皮增厚，气道变窄，严重者可见脱落. 上述病理变化证明哮喘模型建立成功. ZSO治疗组豚鼠肺大体表现：体积无明显变化，表面充血区及出血点有明显吸收的痕迹，面积明显小于哮喘组，出血点数量也明显减少；切片表现为小气道及肺泡壁结构完整，支气管和肺泡腔内分泌物显著减少，肺组织炎性细胞浸润明显减少，无气道狭窄及气道上皮细胞脱落等现象. 地塞米松治疗组病理变化与ZSO治疗组相似，但炎性细胞的减少没有ZSO治疗组明显.

    2.3Giemsa染色肥大细胞的形态学观察高倍镜下观察肥大细胞多沿血管及细支气管分布，尤以细支气管周围聚集显著，肺间质亦有少量散在分布. 经Giemsa染色后肥大细胞颗粒成紫红色，细胞质为蓝色. 与对照组（图1A）相比，哮喘模型组（图1B）肺组织肥大细胞数量较多，体积较小，胞质内颗粒较少，成弱碱性，细胞境界模糊，成桑葚状，在细胞周围的细胞间质中可见肥大细胞颗粒，细支气管管径收缩明显，管腔内有较多丝状分泌物，管壁内有多种炎症细胞浸润. ZSO治疗组（图1C）及地塞米松治疗组（图1D）肺组织肥大细胞呈椭圆形或圆形，数量较模型组明显减少，体积较大，细胞膜光滑完整，少数成脱颗粒状.

    2.4豚鼠肺肥大细胞及血浆类胰蛋白酶含量比较哮喘模型组与对照组相比较，其肺组织高倍视野肥大细胞数、脱颗粒百分率明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)；ZSO和地塞米松两治疗组与哮喘模型组相比降低，差异有统计学意义（P＜0.01），与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05). ZSO治疗组与地塞米松治疗组比较差异无统计学意义(P＞0.05). ZSO和地塞米松两治疗组类胰蛋白酶含量较哮喘模型组均降低，差异有统计学意义(P＜0.01)，与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)；ZSO与地塞米松两治疗组间类胰蛋白酶含量比较均差异无统计学意义(P＞0.05，表1).

    3讨论

    哮喘的发病机制非常复杂，目前被认为与Ⅰ型变态反应密切相关，而肥大细胞是介导Ⅰ型变态反应的重要成分之一. 肥大细胞脱颗粒所释放的类胰蛋白酶能高效诱导中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润、持续A：对照组；B：哮喘模型组；C：椒目油治疗组；D：地塞米松治疗组.表1各组豚鼠肥大细胞数、脱颗粒百分率及类胰蛋白酶含量比较性增加微血管通透性、刺激上皮细胞释放IL8，上调细胞间黏附分子（ICAM1）的表达、促进气道组织纤维化［5］，而炎症性细胞募集、血管通透性增加和ICAM1高表达［6］是哮喘炎症的主要特征， 因此推测类胰蛋白酶在哮喘炎症的发生、和气道重建中起促进作用［7］.

    本实验中发现，ZSO能显著降低哮喘豚鼠肺组织中肥大细胞数量、脱颗粒百分率及血浆类胰蛋白酶含量，从而减轻哮喘发展过程中引起的肺组织充血水肿、炎性细胞浸润甚至出血坏死等病理改变，这表明ZSO能够抑制肥大细胞脱颗粒及类胰蛋白酶诱导的诸多异常改变，从而达到治疗哮喘的目的.

    椒目治疗哮喘在我国悠久，历代名医用椒目单方或复方治疗哮喘，取得了很好疗效［8］. 我们研究ZSO治疗哮喘的机制，为椒目治疗哮喘提供药理学基础. 由于ZSO富含Ca，Mg，Fe，Zn，Sr和Mn等人体必须的矿物质，同时还具有适用范围广、起效时间短、维持时间长、副作用少、来源广泛及价格低廉等优点，因此作为一种新型哮喘治疗药物，ZSO具备良好的开发前景.

    【】

    ［1］ Robinson DS. The role of the mast cell in asthma: Induction of airway hyperresponsiveness by interaction with smooth muscle ［J］. J Allergy Clin Immunol, 2004,114(6):58-65.

    ［2］ Bradding P. The role of the mast cell in asthma: A reassessment ［J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2003,3(1):45-50.

    ［3］ 刘春涛.气道炎症性疾病［M］.北京：人民卫生出版社,2004:506-507.

    ［4］ 赵一岭，黄高升，李玉松，等.改良微波姬姆萨染色法在病理诊断中的应用体会［J］.临床与实验病理学杂志, 1998,14(2)：194-195.

    ［5］ Schwartz LB. Clinical utility of tryptase levels in systemic mastocytosis and associated hematologic disorders［J］. Leuk Res, 2001, 25(7): 553-562.

    ［6］ Bruce SB, William WB. Advances in mechanisms of allergy［J］. J Allergy Clin Immunol, 2004,113(5):868-875.

    ［7］ 谢华，何韶衡，迟秀丽，等. 哮喘患者血浆类胰蛋白酶、IL8和嗜酸性粒细胞趋化因子水平与类糜蛋白酶活性测定及相关性分析［J］.第四军医大学学报, 2004,25(16):1502-04.

    ［8］ 潘金友, 孟炎, 陈孝伯, 等. 椒目油丸治疗哮喘的疗效观察［J］.中药材, 1999,29(2): 103-104