二十碳五烯酸对人肝癌HepG2凋亡细胞线粒体的影响

【关键词】  二十碳五烯酸；HepG2细胞；细胞凋亡；线粒体

   　　Effects of eicosapentaenoic acid on apoptosis and mitochondria in HepG2 cells

     【Abstract】 AIM: To investigate the mitochondria changes in human hepatoblastoma G2 （HepG2） cell apoptosis induced by eicosapentaenoic acid (EPA). METHODS: In the HepG2 cells incubated with EPA in vitro， cell apoptosis was detected by DNA Ladder, the changes of mitochondria function and quantity were determined with methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） colorimetric assay and fluorescence probe. The expression and activity of Caspase9 were measured in HepG2 cell apoptosis with Western blotting and special substrate. RESULTS: Twentyfour hours after exposure to 120 μmol/L EPA， HepG2 cells displayed the apoptosis by the DNA ladder pattern; the number of the mitochondria was decreased; the A value by the MTT test was 0.173±0.065, which indicated that the function of mitochondria was significantly declined (P<0.01); compared with the untreated HepG2 cells, the expression of Caspase9 was upregulated and the activity of Caspase9 was increased to 75.4±4.8 in HepG2 cells treated with EPA (P<0.01). CONCLUSION: The changes of mitochondria may play a great role in the HepG2 cell apoptosis induced by EPA.

    【Keywords】 eicosapentaenoic acid; HepG2 cells; apoptosis; mitochondria

    【摘要】 目的：探讨二十碳五烯酸（EPA）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及其对线粒体的影响. 方法：HepG2细胞与经EPA处理后，DNA Ladder检测细胞凋亡的发生，应用线粒体荧光探针和四唑盐（MTT）比色法分析细胞线粒体数量和功能，应用免疫印迹法和特异性底物检测HepG2细胞Caspase9蛋白酶的表达和活性. 结果：终浓度为120 μmol/L EPA处理HepG2细胞24 h后，可以检测到凋亡标志性的DNA梯形带；细胞线粒体数量减少，MTT比色法检测A值为0.173±0.065（P<0.01），提示线粒体功能降低；线粒体相关凋亡级联反应的启动分子Caspase9蛋白表达增加，Caspase9酶活性增强至75.4±4.8，与未经EPA处理HepG2细胞相比差异有统计学意义（P<0.01）. 结论：EPA可能通过损伤线粒体诱导人肝癌HepG2细胞凋亡.

    【关键词】 二十碳五烯酸；HepG2细胞；细胞凋亡；线粒体

      二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid, EPA）属于n3多不饱和脂肪酸（n3 polyunsaturated fatty acid，n3PUFA），主要存在于深海鱼油中，是一类对人体有益的重要营养素. 近来的研究表明n3PUFA可以抑制肿瘤细胞增殖，具有一定的抗瘤功效［1］，其中诱导肿瘤细胞凋亡可能是主要机制之一［2］. 有研究发现，EPA可以通过p53依赖，Fas介导途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡［3］. 我们采用DNA梯形带检测, MTT比色法和激光扫描共聚焦显微镜检测等方法，通过观察EPA对体外培养的HepG2细胞凋亡和线粒体的影响，初步探讨线粒体损伤在EPA诱导HepG2细胞凋亡过程中所发挥的作用，为进一步研究n3PUFA在抗肿瘤方面的功效提供一定的理论基础.

    1材料和方法

    1.1材料人肝癌HepG2细胞购自院上海生化与细胞所；DMEM培养基购自美国Gibco公司；EPA，四唑盐（MTT）购自美国Sigma公司；线粒体荧光探针MitoTracker Red购自美国Molecular Probe公司；小鼠抗人Caspase9 mAb为美国NeoMarker公司产品；Caspase9蛋白酶特异性底物AcLEHDAMC 为美国Alexis公司产品.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养与分组HepG2细胞常规培养于含有10 mL/L小牛血清的DMEM培养液. 试验分为：处理组HepG2细胞于对数生长期应用EPA（终浓度为120 μmol/L培养液）处理24 h后收获；对照组采用正常培养未经EPA处理的HepG2细胞.

    1.2.2DNA梯形带法检测细胞凋亡细胞经处理后收获约1×106个细胞，PBS洗涤细胞2次，加150 μL NP40裂解液裂解细胞5 h，离心收集上清，150 μL NP40细胞裂解液重复抽提沉淀1次，将上清置于等体积10 g/L SDS溶液中并混匀，加入RNase A（终浓度为2 μg/mL），56℃孵育2 h，加蛋白酶K至终浓度为2 μg/mL，37℃水浴2 h，加1/2体积的10 mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，-20℃过夜，4℃高速离心30 s，弃上清，750 mL/L冰冷乙醇漂洗沉淀，20 μL TE缓冲液溶解DNA，取5 μL DNA进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳.

    1.2.3激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体HepG2细胞制成细胞爬片，处理组细胞经终浓度为120 μmol/L的EPA处理24 h后收获. 两组细胞用无血清培养液冲洗1次，加入线粒体探针MitoTracker Red（无血清培养基1∶5000稀释） 37℃孵育40 min，无血清培养液冲洗3次，应用激光共聚焦显微镜，绿色激发光激发下观察并照相.

    1.2.4MTT比色法检测线粒体功能［4］HepG2细胞传代后培养于6孔板中，每孔5.0×106个细胞，每组设3个复孔. 两组细胞用不含血清的培养液清洗，每孔加入100 μL MTT（5 g/L浓度溶解于PBS中），37℃孵育1 h，弃上清液，每孔加入3 mL细胞裂解液， 570 nm处测量A值. 两组以相同方法重复检测3次.

    1.2.5免疫印迹法检测Caspase9蛋白表达收获处理组和对照组细胞约1×107个，加入100 μL冰预冷的NP40细胞裂解液（50 mmol/L, pH 8.0 Tris・Cl, 150 mmol/L NaCl，25 mmol/L NaF，5 mmol/L Na4P2O7-，1 g/L SDS，1 mmol/L PMSF，10 μg/mL Aprotinin，10 μg/mL Leupeptin，10 g/L NP40）冰上静置裂解30 min，4℃, 12 000 g离心15 min，收集上清，Brodford法测定蛋白含量. 取20 μg蛋白，用细胞裂解液稀释至20 μL，加20 μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸5～10 min，100 g/L SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜，10 g/L BSA室温封闭1 h，然后加入小鼠抗人Caspase9 mAb（1∶100稀释）37℃孵育1 h，使用羊抗鼠SP试剂盒反应，DAB显色.

    1.2.6Caspase9活性检测［5］两组均收获约1×106个细胞，PBS洗涤2次，离心弃上清，加入500 μL细胞裂解缓冲液（10 mmol/L, pH7.5 Tris，30 mmol/L NaCl，10 mmol/L NaF，10 mmol/L NaPi，10 mol/L NaPPi，10 mL/L Trion X100）轻柔重悬细胞沉淀后立即放入液氮中速冻，然后置于-80℃冻存备用. 进行活性分析时，细胞沉淀悬液融化后轻微混匀，18 000 g，4℃离心12 min，取上清以Brodford法进行蛋白定量（读取A595 nm值）. 取100 μL蛋白提取液，加入1.9 mL反应缓冲液（20 mmol/L, pH 7.4 HepesKOH，100 mL/L甘油，20 mmol/L DTT， 20 μmol/L AcLEHDAMC），混匀，37℃避光孵育30～60 min，用荧光分光光度计在狭缝2，激发光380 nm，发射光460 nm条件下测量A460 nm值. 两组以相同方法重复检测3次. 酶活性以A460 nm／A595 nm表示.

    统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS 11.0统计软件进行t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1EPA诱导HepG2细胞凋亡的检测DNA梯形带检测结果显示HepG2细胞染色质DNA裂解成180～200 bp和不同倍数的片段，在琼脂糖凝胶电泳显示出凋亡细胞特有梯形带（图1）.

    2.2EPA对HepG2细胞线粒体数量的影响线粒体荧光探针可以特异性标记细胞线粒体，在绿色激发光激发下发出红色荧光. 激光共聚焦显微镜下可见未经EPA处理的HepG2细胞生长状态良好，红色荧光明亮，均匀分布于胞质区. 经120 μmol/L EPA处理 24 h后，HepG2细胞生长稀疏，形态趋于圆形，荧光强度明显减弱，提示细胞线粒体数量明显减少（图2）.

    2.3EPA对HepG2细胞线粒体功能的影响研究结果显示，未经EPA处理的HepG2细胞测得A570 nm值为0.470±0.023，经120 μmol/L EPA处理 24 h后测得HepG2细胞A570 nm值为0.173±0.065，差异具有统计学意义（P<0.01）.

    2.4EPA对HepG2细胞Caspase9蛋白酶表达和活性的影响免疫印迹检测结果显示Caspase9蛋白表达增加. 以特异性荧光底物分析Caspase9蛋白酶活性，结果表明，未经EPA处理的HepG2细胞Caspase9活性为32.7±3.6， 经EPA处理24 h后细胞Caspase9活性达到75.4±4.8，差异具有统计学意义（P<0.01，图3）.

    3讨论

    作为一种人体需要的重要营养素，n3PUFA的抗瘤功能逐渐受到关注. 研究发现n3PUFA可以诱导肿瘤细胞凋亡［6］，而我们使用EPA处理肝癌HepG2细胞后可以检测到凋亡标志性的DNA梯形带，说明EPA也可以在体外诱导肝癌HepG2细胞凋亡的发生.

    线粒体是参与细胞凋亡的关键因素，目前的观点认为线粒体既是细胞凋亡的启动者，又是凋亡信号的放大者. 凋亡过程中一个重要的特征就是线粒体膜功能的改变即线粒体的通透性改变，这是调节凋亡的中心环节. 凋亡诱导因素可以诱导MPT开放，导致线粒体跨膜电位(△ψm)下降或消失，随后呼吸链脱耦联，造成线粒体自身损伤，产生活性氧类及向胞质释放多种蛋白酶活化物，包括凋亡诱导因子（apoptosisinducing factor, AIF）,细胞色素C(Cyt C)和凋亡蛋白酶激活因子1（apoptosis protease activating factor1, Apaf1）等. AIF可以直接进入细胞核，导致染色体浓缩、断裂［7］. 而Caspase9蛋白酶是线粒体依赖Caspase级联反应的启动分子，与线粒体释放的Cyt C和Apaf1结合形成凋亡复合体后被激活，活化的Caspase9可以进一步裂解活化下游Caspase蛋白酶，启动Caspase级联反应，进一步诱导细胞凋亡的发生. 国外曾报道在n3脂肪酸诱导人白血病HL60细胞凋亡过程中，线粒体去极化和上调半胱氨酸蛋白酶（Caspase）的表达和/或活性可能与此过程密切相关［8］.

    我们的试验结果表明，HepG2细胞经EPA处理后，细胞生长减缓，死亡细胞增多，同时可以观察到细胞线粒体数目明显减少，应用MTT比色法检测细胞线粒体功能，发现在EPA作用下HepG2细胞线粒体功能显著降低. 对细胞Caspase9蛋白酶的检测结果表明，在EPA作用下HepG2细胞Caspase9蛋白酶表达增加，活性增强. 由此我们认为在诱导HepG2细胞凋亡的过程中，EPA对细胞线粒体结构和功能的影响可能发挥了重要作用，其中线粒体依赖的Caspase级联反应可能是凋亡事件的重要组成部分. 此外，有报道EPA可以通过促进线粒体生成过氧化物，释放AIF1，通过不依赖Caspase的途径诱导鼠白血病RBL2H3细胞凋亡［9］，但在EPA诱导HepG2细胞凋亡过程中是否存在相同机制还有待进一步研究.

    【】

    ［1］ Schley PD, Jijon HB, Robinson LE, et al. Mechanisms of omega3 fatty acidinduced growth inhibition in MDAMB231 human breast cancer cells ［J］. Breast Cancer Res Treat, 2005, 92(2):187-195.

    ［2］   Heimli H, Hollung K, Drevon CA. Eicosapentaenoic acidinduced apoptosis depends on acyl CoAsynthetase［J］. Lipids, 2003, 38(3):263-268.

    ［3］   Chi TY, Chen GG, Lai PB. Eicosapentaenoic acid induces Fasmediated apoptosis through a p53dependent pathway in hepatoma cells［J］. Cancer J, 2004, 10(3):190-200.

    ［4］   Hansen MB, Nielsen SE, Berg K. Reexamination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill ［J］. J Immunol Methods, 1989, 119(2):203-210.

    ［5］   Reiners JJ Jr, Clift RE. Aryl hydrocarbon receptor regulation of ceramideinduced apoptosis in murine hepatoma 1c1c7 cells. A function independent of aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator［J］. J Biol Chem, 1999, 274(4): 2502-2510.

    ［6］   Shirota T, Haji S, Yamasaki M, et al. Apoptosis in human pancreatic cancer cells induced by eicosapentaenoic acid［J］. Nutrition, 2005, 21(10):1010-1017.

    ［7］   于翠娟,孟艳玲,王成济,等. 凋亡诱导因子是线粒体内介导核凋亡的最主要蛋白质之一［J］.第四军医大学学报，2002, 23(17): 1599.

    ［8］   Arita K, Kobuchi H, Utsumi T. Mechanism of apoptosis in HL60 cells induced by n3 and n6 polyunsaturated fatty acids［J］. BiochemPharmacol, 2001, 62(7): 821-828.

    ［9］  Koumura T, Nakamura C, Nakagawa Y. Involvement of hydroperoxide in mitochondria in the induction of apoptosis by the eicosapentaenoic acid［J］. Free Radic Res, 2005, 39(3):225-235.