不同地区铜绿假单胞菌第一类整合子和整合子相关基因盒的分布
【关键词】 铜绿假单胞菌；,,第一类整合子；,,整合子相关基因盒
摘要： 目的 对石家庄、昆明两地分离的铜绿假单胞菌临床菌株进行第一类整合子的分布及整合子相关基因盒携带率的比较分析，探讨第一类整合子在两地菌株分布的差别。方法 采用PCR方法筛选检测64株石家庄、昆明两地临床分离的铜绿假单胞菌第一类整合子和及其所携带的整合子相关基因盒。结果 64株铜绿假单胞菌临床菌中共有43株为第一类整合子阳性菌(阳性率672%)；其中石家庄菌株和昆明菌株阳性率分别为714%和643%，两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率无显著性差异。第一类整合子阳性铜绿假单胞菌中，石家庄菌株和昆明菌株携带一类整合子相关基因盒的阳性率分别为800%和38%，两地第一类整合子阳性菌中整合子相关基因盒的携带率具有显著性差异(P<001)；两地菌株携带的基因盒大小不同。结论 第一类整合子在铜绿假单胞菌临床菌株中广泛分布，环境的选择压力影响细菌整合子相关基因盒的分布。
关键词： 铜绿假单胞菌； 第一类整合子； 整合子相关基因盒
Distribution and identification of class 1 integrons and integrated gene cassettes
ABSTRACT Objective The distribution and characterization of the class 1 integrons (int1) and integrated gene cassettes among Pseudonmonas aeruginosa strains from different geographic regions were investigated. Methods 64 clinical strains of P.aeruginosa were isolated from Shijiazhuang and Kunming hospitals, China. The presence and genetic content of int1 and integrated gene cassettes were examined by PCR method. Results The incidence of int1 in the 64 clinical isolates of P.aeruginosa was 672% (43/64), in which the incidences of int1 carried by the strains from Shijiazhuang and Kunming were 714% and 643% respectively. Of 43 clinical isolates harboring intI1, 27 carried the integrated gene cassttes and 16 were found to lack integrated gene cassttes. The incidences of gene casstte were 800% and 384% in int1 positive strains from Shijiazhuang and Kunming. Conclusion Results revealed that integron structures were widespread in clinical isolates of P.aeruginosa. The antibiotic selective pressures play a significant role in the distribution of integrated gene cassettes in bacteria.KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; Integron; Integrated gene cassette收稿日期：20050706 修回日期：20050917
随着抗生素在临床抗感染上的广泛使用，细菌耐药性问题日益严重，细菌间基因的水平转移是细菌多重耐药性形成和广泛传播的重要原因。整合子(integron)系统具有捕获和表达外来耐药基因盒的能力，细菌可以通过该系统中的整合酶基因(intI)编码的整合酶(integrase)不断地从周围环境中捕获和积累耐药基因盒，形成巨大的耐药基因多基因座。整合子可存在于质粒、转座子等可移动的基因元件上，在同种或不同种属的细菌之间进行基因的水平转移［1，2］。整合子在多重耐药菌的形成及耐药基因的水平播散中起重要作用。研究表明，环境的抗生素选择压力对整合子及耐药基因在细菌中的分布起着重要作用，在革兰阴性细菌中发现的很多抗生素耐药基因都是作为基因盒的一部分而插入在整合子中的［3，4］。目前根据整合子中整合酶基因(intI)的不同，将已经发现的整合子分为六类，其中第一类整合子最常见。本研究对石家庄、昆明两地临床分离的耐药性突出的院内感染条件致病菌铜绿假单胞菌进行第一类整合子的筛选及基因盒比较分析。
1 材料和方法
1.1 菌株临床分离铜绿假单胞菌69株，分别分离自石家庄(PA1～PA39)和昆明(PA40～PA69)的；第一类整合子阳性对照菌株为V.cholerae O1 strain SK 10，由Department of Veterinary Microbiology，Denmark的Anita Forslund博士惠赠；第一类整合子阴性对照菌株为E.coli C600，由日本大阪府立大学国际防疫学研究室山崎伸二教授惠赠。
1.2 铜绿假单胞菌第一类整合子的检测
1.2.1 DNA模板的制备 将临床分离的铜绿假单胞菌、整合子阳性及阴性对照菌株分别接种于LB培养基中过夜培养；取菌液50μl，悬浮在450μl双蒸水中，在沸水中煮10min后，立即在冰中冷却。稍后在10000r/min条件下离心，上清液为粗提DNA，-80℃保存。
1.2.2 第一类整合子整合酶基因(intI1)扩增 设计引物intI1U(5′GTTCGGTCAAGGTTCTG3′)和intI1D(5′GCCAACTTTCAGCACATG3′)扩增intI1。PCR体系总体积为50μl，其中包括10×PCR缓冲液5μl，模板DNA2μl，dNTP混合物(each 25mmol/L)4μl，上、下游引物(10pmol)各15μl，rTaq DNA聚合酶025μl(5U/μl，TaKaRa生物工程公司)，无菌双蒸水3675μl。PCR条件：94℃变性5min；94℃ 05min，52℃ 1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸7min。将PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，凝胶经溴化乙啶染色，在凝胶成像系统(BIORAD Gel Dec EQ)下照像。
1.3 第一类整合子相关基因盒扩增对以上筛选的第一类整合子阳性菌进第一类整合子相关基因盒扩增。设计引物inF(5′GGCATCCAAGCAGCAAGC3′)和inB(5′AAGCAGACTTGACCTGAT3′)扩增第一类整合子相关基因盒。PCR反应体系为10×缓冲液5μl，dNTP(25mmol/L each)4ul，inF和inB各3μl，rTaq DNA聚合酶(5U/μl)025μl，模板DNA 2μl，加无菌双蒸水至50μl。PCR条件：94℃变性5min；94℃30s，52℃ 1min，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸7min。将PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，凝胶经溴化乙啶染色，在成像系统下照像。
1.4 统计学分析采用χ2检验，分析两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率及整合子相关基因盒的携带率有无差别。
2 结果
2.1 铜绿假单胞菌第一类整合子检测结果64株铜绿假单胞菌临床菌株中共有43株菌扩增产生了923bp的产物，即携带第一类整合子，阳性率为672%，其中25株为分离自石家庄的临床菌株(阳性率为714%)，18株为分离自昆明的临床菌株(阳性率为643%)(Tab.1和Fig.1)。
2.2 第一类整合子相关基因盒扩增在25株分离自石家庄的第一类整合子阳性铜绿假单胞菌中有18株菌(阳性率为800%)扩增出基因盒，7株菌携带空的整合子；基因盒大小约为：1700、1900、2400和2600bp。在18株分离自昆明的第一类整合子阳性菌株中有7株菌扩增出基因盒(阳性率389%)，11株菌为空整合子；基因盒大小约为：2500、2900和3400bp(Tab.2和Fig.2,3)。
2.3 统计学分析经χ2检验，两地铜绿假单胞菌第一类整合子阳性率无显著性差异；两地第一类整合子阳性菌中整合子相关基因盒的携带率具有显著性差异(P<001)。
3 讨论
细菌耐药性主要源于细菌自身基因的突变和外源耐药基因的获得。细菌的自发突变率几率小(10-6～10-8)且不稳定，在无持续选择压力的环境下，细菌很难形成稳定的耐药性，所以外源耐药基因的获取是细菌获得耐药性的主要途径。细菌可通过质粒、转座子等可移动的遗传因子将耐药基因在细菌间进行耐药基因的水平转移。整合子这种携带位点特异性重组系统基因片段，虽不具自主移动传递功能，但其常存在于质粒或转座子上，具有潜在的移动功能，尤其是整合子可以不断地通过整合酶从周围环境捕获耐药基因盒并将其组装在一起，形成巨大的耐药基因多基因座，使菌体具有多重耐药性。研究认为，整合子是细菌天然存在的克隆与表达系统，但环境中抗菌药物的选择压力直接影响细菌整合子的分布及耐药基因盒的携带率。在临床抗生素耐药分离株中整合子的出现率为59%～75%，而在非选择性的革兰阴性临床分离株中有13%的菌株携带有整合子［5］。在我国广东从正常人群分离的沙门菌中有17%携带第一类整合子［6］。Rosser等从河水中分离的3000株革兰阴性菌中筛出的85株带整合子第一类整合子，阳性率仅为36%，并且一半以上的整合子不携带耐药基因［7］，即为空整合子。也就是说在没有抗生素压力的环境中，细菌整合子的发生率和整合子相关基因盒的携带率低随着环境中抗生素压力的增高，整合子的发生率及基因盒的携带率也相应提高。本实验就第一类整合子在石家庄、昆明两地临床分离的铜绿假单胞菌的分布进行了初步研究。研究表明两地临床分离的铜绿假单胞菌中第一类整合子的携带率较高，两者没有显著性差异；但两地整合子阳性菌中整合子相关基因盒的携带率差距较大，石家庄菌株基因盒携带率约为昆明菌株的两倍，两者具有显著性差异。石家庄与昆明的地理位置相距较远，两地的医疗环境及用药背景有一定差别，以致两地区细菌面临的选择压力不同，这或许是两地整合子相关基因盒携带率不同的原因之一。
整合子的存在是细菌多重耐药形成和传播的主要内在机制，而抗生素的选择压力是导致细菌耐药性存在、的主要客观因素。如何合理使用抗生素，控制细菌耐药性形成是21世纪临床医学迫在眉睫的任务。
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