反式头孢丙烯的酶法合成及其体外抗菌活性
作者：冯胜昔 梁世中 龟山丰
【关键词】 ,反式头孢丙烯；,,酶法合成；,,7
摘要： 以7苯乙酰氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式GPRA)为原料，在青霉素酰化酶作用下，首先酶法水解得到3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式APRA)，过滤固相酶，滤液调pH分离得到反式APRA固体；在青霉素酰化酶作用下，反式APRA再与对羟基苯甘氨酸乙二醇酯缩合，得到反式头孢丙烯；酶法合成所得的产品与进口反式头孢丙烯对照品一致。初步体外抗菌试验表明，反式头孢丙烯对金葡菌和大肠埃希菌的体外抗菌活性比临床用头孢丙烯(顺式900%，反式9%)弱。
关键词： 反式头孢丙烯； 酶法合成； 7苯乙酰氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式GPRA)； 7氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式APRA)； 青霉素酰化酶(IPA750)； 抗菌活性
Enzymatic synthesis and in vitro antibacterial activity of transcefprozil
ABSTRACT Immobilized penicillin acylase (from E.coli) was used to catalyze 7phenylacetamido3Epropenylcephalosporanic acid (transGPRA) hydrolyzation into 7amino3Epropenylcephalosporanic acid (transAPRA). Then, transAPRA was acylated with hydroxyethyl ester of 4hydroxyDphenylglycine (HPGHE) to obtain transcefprozil. The activities of transcefprozil and cefprozil (cis 90%, trans 9%) against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were tested. Transcefprozil showed less activity than cefprozil.
KEY WORDS Transcefprozil enzymatic synthesis; Penicillin G acylase; 7Phenylacetamido3Epropenylcephalosporanic acid (transGPRA); 7amino3Epropenylcephalosporanic acid (transAPRA); Antibacterial activity
头孢丙烯(cefprozil，曾称头孢罗齐)是BristolMyers公司研究开发的非酯型口服头孢菌素［1］，1992年以Cefzil的商品名在美国首次上市，是美国FDA批准的第一个可用于儿童中耳炎和鼻窦炎的口服头孢菌素类抗生素，杀菌机制是阻碍细菌细胞壁合成，安全性好，不良反应极低。头孢丙烯具备以下几个特点：①属第二代头孢菌素类抗生素， 抗菌谱广并较均衡，抗菌活性强，对β内酰胺酶具有较好的稳定性；②吸收迅速，生物利用度高达94%；③治疗呼吸道感染和皮肤软组织感染疗效均达90%以上；④每日仅需口服1～2次，方便；⑤药物吸收不受食物的影响。头孢丙烯已收载在美国药典中，为美国临床医生推荐的品种之一。由于头孢丙烯C3位连接的是丙烯基，故该化合物存在两个几何异构体，一个为顺式头孢丙烯，一个为反式头孢丙烯，临床上使用的是混合体，美国药典［2］明确规定临床用的头孢丙烯， 顺式含量89%～94%，反式含量为6%～11%，测定方法为外标法。［3］报道顺式头孢丙烯的抗菌活性，对金葡菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌等有效。Natto等［4］报道，以7氨基3氯甲基3头孢菌素4羧酸二苯甲酯为起始原料，通过缩合、碘代、Wittig反应、断保护基等步骤得到头孢丙烯。Usher等［5］以7氨基3丙烯基3头孢菌素4羧酸为起始原料，在青酶素酰化酶的作用下，与对羟基苯甘氨酸乙二醇酯缩合，得到头孢丙烯［5］。本文报道以7苯乙酰氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式GPRA)为原料，在青霉素酰化酶作用下，首先酶法水解得到3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式APRA)，过滤固相酶，滤液调pH分离得到反式APRA固体；然后，反式APRA与对羟基苯甘氨酸乙二醇酯，在青霉素酰化酶作用下，缩合得到反式头孢丙烯，反应过程如图1所示，所得的产品与进口反式头孢丙烯对照品一致； 并对反式头孢丙烯进行初步抗菌试验研究。
图1 反式头孢丙烯的酶法合成（略）
1 实验部分
1.1 主要实验材料和仪器实验材料 IPA750固定化青霉素酰化酶来源于大肠埃希菌，酶活550U/g，购自长沙富来格公司；反式头孢丙烯对照品购自美国USP公司，批号09804F1；7苯乙酰氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式GPRA)由广州白云山化学制药厂自制，对羟基苯甘氨酸购自浙江横店公司；试验菌金葡菌(Staphylococcus aureus)ATCC6538和大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC8739由广东省微生物研究所提供；培养基为营养琼脂培养基(蛋白胨50g，牛肉浸膏30g，琼脂150g，蒸馏水1000ml，pH70，25℃)。仪器及设备 HPLC，岛津LC20AT，SPD20A紫外检测器，C18反相柱(150mm×4mm，5μm；Alltech，USA)，流动相为乙腈∶磷酸盐缓冲液(5∶95)，磷酸盐缓冲液1450克磷酸二氢胺加至1000ml H2O，用磷酸调pH至44；检测波长280nm；核磁共振仪为Varian INOVA500；离心机为TGL16G；Anke，上海产。
2 实验过程与结果
2.1 对羟基苯甘氨酸乙二醇酯的制备以对羟基苯甘氨酸为原料参照文献［5］方法制备。
2.2 7氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式APRA)的制备7苯乙酰氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式GPRA)(27g，75mmol)和H2O(40ml)加至反应瓶中，滴加氨水调物料pH至80，物料溶清，然后加入H2O调整物料体积50ml，调温28～30℃，加入IPA750(13g)，滴加氨水维持物料pH80，反应3h。过滤，滤液中滴加3mol/L HCl调pH20，析出7氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式APRA)类白色晶体，重164g，收率901%，纯度985%，1HNMR(D2O/Na2CO3)δ190(3H，dd，J=70，10)；376(2H，d，J=70)；511(1H，d，J=45)；533，(1H，d，J=50)；643(1H，dd，J=160，70)；700(1H，dd，J=155，15)。
2.3 反式头孢丙烯的制备将90ml蒸馏水加至三口瓶中，加入对羟基苯甘氨酸乙二醇酯(535g，250mmol)，搅拌，调温10℃，滴加氨水调物料pH至80，加入反式APRA(15g，625mmol)，搅拌至溶清，滴加3mol/L HCl调pH至65，量物料体积，加入适量水调物料总体积为100ml，调温15℃，加入IPA750固定化酶(30g)，滴加氨水维持物料pH至65，定时从反应液中取样，离心(12000r/min，5min)，取上清液测试含量。反应40min，HPLC测试反式头孢丙烯生成率953%，即刻过滤，用10ml蒸馏水洗涤固相酶，合并滤液，过HP20柱，用水洗脱，含有反式头孢丙烯洗脱液冷冻干燥，得到反式头孢丙烯(144g)，分离收率593%，纯度976%，1HNMR(D2O)δ179(3H，dd，J=70，15Hz)；350(2H，s)；509(1H，d，J=40Hz)；513(1H，s)；563(1H，d，J=40Hz)；616(1H，dd，J=70，150Hz)；672(1H，dd，J=15，15Hz)；694(2H，d，J=65Hz)；735(2H，d，J=65Hz)，与进口反式头孢丙烯对照品一致。
2.4 反式头孢丙烯抗菌试验抗菌活性采用滤纸片扩散法测定。试验菌为金葡菌ATCC6538和大肠埃希菌ATCC8739。供试化合物反式头孢丙烯和对照品临床用头孢丙烯(顺式91%，反式9%)分别用蒸馏水配置成1000、100和10mg/L三种浓度。每个培养皿中加入实验菌悬液02ml，用T型涂布器均匀涂抹于整个培养基表面。取20μl待测样品溶液于直径6mm的滤纸片上，稍干后贴在已接菌的琼脂平板表面，每个培养皿放4片，每个处理设3个重复，在28℃恒温箱培养24h，观察、记录抑菌圈大小，并与阳性对照药相比，用十字交叉法测抑菌圈的直径，取其平均值作为实验结果，依此评价供试化合物的抑菌活性。由表1可见，反式头孢丙烯对金葡菌ATCC6538和大肠埃希菌ATCC8739有抗菌活性，但体外抗菌活性比临床用头孢丙烯(顺式91%，反式9%)弱。对其它菌的体外活性在进一步研究之中。
3 讨论
本文报道以7苯乙酰氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式GPRA)为原料，在青霉素酰化酶作用下，首先酶法水解得到7氨基3E丙烯基3头孢菌素4羧酸(反式APRA)，然后在青霉素酰化酶作用下， 反式APRA与对羟基苯甘氨酸乙二醇酯缩合， 得到反式头孢丙烯，酶法制备的反式头孢丙烯含量高，与进口反式头孢丙烯对照品一致。体外抗菌实验表明，反式头孢丙烯对金葡菌和大肠埃希菌的体外抗菌活性比顺式头孢丙烯弱，说明不同的异构体抑菌效果有差异，而在合成中，得到的是顺反异构体，所以临床使用的头孢丙烯对异构体比例需加以控制。
表1 反式头孢丙烯和临床用头孢丙烯(顺式91%，反式9%)对金葡菌和大肠埃希菌的抑菌圈直径（略）
［1］ 唐建国. 口服头孢菌素头孢丙烯［J］. 国外医药抗生素分册，1998，19(5)：350
［2］ United States Pharmacopeial Convention. The United States Pharmacopeial ［S］. Rockille: United States Pharmacopeial Lonvention, Inc.,2002:351
［3］ Leitner F, Pursiano T A, Buck R E, et al. BMY 28100, a new oral cephalosporin ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1987,31(2):238
［4］ Natto T, Hoshi H, Aburaki S, et al. Synthesis and structureactivity relationships of a new oral cephalosporin, BMY28100 and related compounds ［J］. J Antibiot,1987,40(7):991
［5］ Usher J J, Romancik G. Synthesis of βlactam antibacterials using soluble side chain esters and enzyme acylase ［P］. WO 9804732,19980205
