Egr1基因剔除对雨蛙素诱导小鼠胰腺炎的影响

           作者：段佑才, 姜泊, 智发朝, 宋于刚, 陈学清

【关键词】  急性病

    Knockout Egr1 ameliorates cearuleininduced  pancreatitis in mice

　　【Abstract】  AIM:   To study the role of Egr1 in the initiation of acute pancreatitis. METHODS:  Experimental pancreatitis was induced in the Egr1 knockout mice with highdose of cearulein. The pancreatitis indices such as water content of pancreas, serum amylase and myeloperoxidase (MPO) activities were measured. The histology of pancreas and lung was observed under microscopy. RESULTS:  The water content of pancreata in Egr1 knockout mice was significantly reduced ［（166.0±13.5）%  vs (132.3±17.7)％, P<0.05］. No significant difference of MPO levels in pancreata and serum amylases was found between the wildtype and Egr1 knockout mice. However, the lung MPO levels in Egr1 knockout mice were significantly reduced compared with those in wildtype mice ［（168.1 ± 41.7）% vs (274.0 ± 98.7% ), P<0.05］. In Egr1 knockout mice, the histological appearance in pancreas and lung improved, though some vacuoles in acinar cells and light edema in pancreas were observed in pancreas. CONCLUSION:  The severity of pancreatitis and lung damage is ameliorated in Egr1 knockout mice stimulated by highdosage of cearulein, suggesting that Egr1 is one of the important factors in the initiation of acute pancreatitis.

　　【Keywords】 acute disease; pancreatitis; early growth response factor 1; mice, knockout

　　【摘要】  目的： 探讨Egr1在实验性胰腺炎发病中的作用.  方法： 利用Egr1基因剔除小鼠，采用大剂量雨蛙素诱导的实验性胰腺炎模型，观察Egr1基因剔除后，胰腺组织水肿，组织髓过氧化物酶（MPO）水平，血清淀粉酶水平，肺组织MPO水平，以及胰腺与肺组织学改变. 结果： 与野生型相比，Egr1基因剔除小鼠胰腺组织水肿明显减轻［（166.0 ± 13.5）% vs  (132.3 ± 17.7)%,  P<0.05］，但组织MPO水平与血清淀粉酶与野生型组间相比无明显改变；肺组织MPO水平与野生型组相比明显降低［（168.1 ± 41.7）%  vs （274.0 ± 98.7）%, P<0.05］. 在组织学上，Egr1基因剔除组胰腺和肺组织学明显改善，但胰腺腺泡仍有空泡变性及轻度肿胀. 结论： Egr1基因剔除可明显减轻实验性胰腺炎胰腺和肺组织的损伤.

　　【关键词】 急性病；胰腺炎；早期生长反应因子1；小鼠，基因敲除

　　0引言

　　前炎性转录因子及炎性因子在急性胰腺炎的发生和中有重要作用. 其中，核转录因子 κB (nuclear factor κB, NFκB)及其靶因子的研究加深了人们的认识［1-4］.  核转录因子早期生长反应因子1(early growth response1)在实验性胰腺炎早期高表达［5］.  Egr1是炎症启动的关键因子，可能在急性胰腺炎的启动中有着十分重要的作用［6］. 为进一步研究Egr1在急性胰腺炎中的作用，我们利用Egr1基因剔除小鼠，用大剂量的雨蛙素诱导制造急性胰腺炎模型，对Egr1的作用进行探讨.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　Egr1基因缺失(Egr1 KO)小鼠 (美国华盛顿大学Jeffrey Milbrandt 同意使用)饲养于12 h明亮/黑暗环境中，自由进食和饮水. 由于Egr1 KO的小鼠无生殖能力，故用杂合子的Egr1基因缺失小鼠交配繁殖可得到Egr1 KO小鼠，杂合子小鼠及正常小鼠（野生型，wildtype, WT）. 小鼠基因型分析鉴定采用PCR方法. 将出生3～4 wk的小鼠用蛋白酶K 55℃过夜消化后，加5 mol/L的氯化钠离心得上清，再将上清中入预冷的乙醇中，其沉淀物即基因组DNA. 基因型鉴定用常规PCR方法，引物为：  egr1 上游 5′AACCGGCCCAGCAAGACC 3′， 下游 5′ GGGCACAGGGGATGGGAATG 3′ 产物片段400 pb； neo基因：  5′CTCGTGCTTTACGGTATCGC 3′，和egr1上游引物一起使用，产物片段420 bp.
 
　　1.2方法

　　小鼠（雌雄不拘，22～26 g）在实验前禁食24 h，但可自由饮水. 雨蛙素（cearulein，Sigma）溶于生理盐水中(50 g/L), ip［50μg/(kg・h）］5 h诱导实验性胰腺炎结束时，用乙醚麻醉后剪开胸腔，抽取心内血液，并取少量肺组织. 然后，剪开腹腔，显露胰腺组织，小心剪下放入预冷的中性PBS液（pH 7.4）中，并剔除脂肪. 一部分固定于中性100 g/L的多聚甲醛，其它放入液氮中冷冻后，-70℃保存. 血液离心后取血清，分装后-70℃保存. 正常对照组（control, Con）小鼠注射同体积的生理盐水. 实验分正常对照组，野生型雨蛙素组（WT）和Egr1基因剔除雨蛙素组（KO），每组5只. 血清淀粉酶（Phadebas淀粉酶试验）、组织髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）、组织含水的比率的检测，以及组织学检查［3］进行. 其中酶活性和含水量，均为与对照的百分比来表示.
 　　
　　统计学处理： 数据均用(x±s)表示. 用SSPS 10.0软件F检验对数据进行分析.

　　2结果

　　大剂量的雨蛙素可明显引起胰腺炎，胰腺组织表现为急性水肿、组织间隙增宽，胰腺腺泡细胞明显肿胀，少数细胞表现为空泡变性（Fig 1A），而正常对照组胰腺组织在组织学上没有明显的改变（Fig 1B）. 在组织学上，KO组（Fig 1C）无明显水肿，组织间隙无明显增宽，其组织水肿与正常对照组相比也无明显的差异. 但是，胰腺腺泡细胞仍轻度肿胀及空泡变性，并可见少量炎性细胞的浸润. 血清淀粉酶［( 624.9±24.3)%］、组织MPO［( 235.3±64.5)%］和组织含水量( 166.0±13.5)%在WT组与正常对照组织相比也均明显升高（Fig 1D），与文献报道相似. 但是，大剂量雨蛙素不能诱导Egr1 KO小鼠出现典型的实验性胰腺炎. 对胰腺炎指标的检测表明，KO组的血清淀粉酶( 565.0±38.0)%和组织MPO［( 235.0±49.6)%］与WT组间无明显差异，但KO组的组织含水量明显减低［（132.3±17.7）％］（Fig 1D）. 结果表明，Egr1基因剔除，可明显减轻胰腺组织的水肿. 在组织学上，与正常对照组（Fig 2A）和KO组（Fig 2B）相比，WT组（Fig 2C）肺组织有大量的炎性细胞浸润. 对肺组织MPO的检测（Fig 2D）也表明，WT组［(274.0 ± 98.7)%］明显高于对照组和KO组［(168.1 ± 41.7 )%］，但同时，KO组与正常对照组相比，MPO水平也明显增高. 结果提示，Egr1基因剔除，可以明显减轻实验性胰腺炎肺组织的炎症.

　　3讨论

　　我们利用Egr1基因剔除小鼠，对Egr1在急性胰腺炎中的作用探讨发现，在雨蛙素诱导的胰腺炎模型中，Egr1基因剔除可明显减轻胰腺组织的水肿，表明Egr1对TF有调节作用［5］. Egr1基因剔除对于组织MPO及血清淀粉酶无明显影响. 由于NFκB是急性胰腺炎炎症的重要调节因子［3］，而且胰腺炎发生时胰酶本身对于胰腺组织的可能的直接损伤作用，所以，我们认为胰腺本身的炎症和损伤在很大程度上可能与NFκB和胰腺激活有关［7］. 我们的结果提示，NFκB和胰酶的激活在对胰腺组织直接损伤方面可能起着较为重要的作用.

　　虽然Egr1基因剔除不能完全减轻胰腺腺泡细胞损伤，但可明显减轻肺组织的损伤. 以前的研究表明，如果减少炎症因子如ICAM1，C5a在肺组织中的表达［2, 8］，可明显减轻肺组织的炎性浸润. 所以，肺组织的炎症损伤是急性胰腺炎全身炎症反应的一部分. 因此我们推测，Egr1基因剔除减轻肺组织的炎症和损伤可能是通过减少胰腺组织所释放的炎性因子所致.

　　【】

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