牙本质涎磷蛋白G0代转基因小鼠的获得

           作者：孙汉堂，肖明振，吴补领，徐国江，费俭

【关键词】  牙本质涎磷蛋白

    Generation of transgenic mouse founders of DSPP

　　【Abstract】 AIM: To establish tetracyclineresponsive regulated transgenic mice of dentin sialophosphoprotein (DSPP). METHODS:  DSPP coding sequence was contained in plasmid pBluescriptDSPP and the transgenic vector was constructed by subcloning it into pTRE2 by NotI/SalI digestion. Following identification by enzyme digestion and sequencing, the final plasmid was named pTRE2DSPP. After linearized by XhoI and recovery, the plasmid was microinjected into the male pronucleus of the zygotes and the zygotes in good condition were implanted into pseudopregnant mice. The tail DNA of 3 weekpups was tested by PCR and Southern blot. RESULTS:  Six hundred and fiftyseven embryos were implanted to 28 recipient pseudopregnant mice, with 6 of the 85 pups carrying the transgene. The establishment of the transgenic line progressed from the 6 positive ones. CONCLUSION: The founders of the tetracyclineresponsive regulated transgenic mice of DSPP are established successfully.

　　【Keywords】  tooth; dentin sialophosphoprotein; mice, transgenic; microinjections

　　【摘要】 目的： 构建四环素调控性牙本质涎磷蛋白（DSPP）转基因体系中的受控小鼠系. 方法： 从质粒pBluescriptDSPP中，将小鼠DSPP编码序列亚克隆到pTRE2的NotI/SalI位点间，构建转基因载体，经酶切鉴定和测序确认后，命名为pTRE2DSPP；将XhoI酶切线性化的载体DNA纯化后，显微注射到小鼠受精卵的雄原核中，挑选生长状态好的受精卵，移植到假孕母鼠的输卵管. 仔鼠出生3 wk后，用PCR及Southern Blot检测阳性小鼠. 结果： 注射的受精卵共存活657枚，移卵至28只假孕母鼠后，产仔85只，PCR检测10只为阳性，Southern Blot检测6只为阳性. Southern Blot检测阳性小鼠分别传代，开始建系. 结论： 显微注射方法获得了DSPP转基因受控小鼠的G0代.

　　【关键词】 牙；牙本质涎磷蛋白；小鼠转基因；微量注射

　　0引言

　　牙本质涎磷蛋白是成牙本质细胞和牙髓干细胞的标志性蛋白［1，2］.  为动态地研究DSPP在牙齿发育、矿化不同阶段的作用，以及对机体其他器官的可能影响，我们首先用显微注射法获得了G0代DSPP转基因小鼠.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　质粒pTRE2, pBluescriptDSPP为院上海生物化学与细胞生物学研究所基因工程组保存或构建；PCR试剂盒购自Takara公司（日本），限制性内切酶、连接酶、随机引物DNA标记试剂盒购自New England Biolabs公司（英国），凝胶DNA纯化试剂盒、质粒DNA大量抽提试剂盒购自Qiagen公司（德国），蛋白酶K粉剂购自华美公司（中国），杂交液ExpressHyb Hybrization Solution购自Clontech公司(美国)，引物由申友公司（中国）合成. 　　仪器包括Leica显微操作仪，PerkinElmer PE9700型PCR仪，BioRad SmartSpec 3000 紫外分光光度计， GIS凝胶图像处理系统. 4 wk以上性成熟SPF级B6CBA/F1（为CBA♂鼠与C57BL/6J♀鼠杂交F1代）小鼠，由上海南方模式生物研究中心SPF级动物房提供.

　　1.2方法

　　质粒pBluescriptDSPP 先PvuI酶切，然后NotI/SalI酶切，可获得含DSPP编码序列的片段（约3.0 kb）,与经过NotI/SalI酶切的线性化pTRE2于16℃连接过夜；转化，挑克隆NotI/SalI酶切鉴定，序列测定，命名为pTRE2DSPP. XhoI酶切线性化，电泳回收，-20℃保存备用. 供卵鼠于明暗循环的明循环中点ip孕马血清（PMS）10 IU, 46 h后注射HCG 10 IU，并与公鼠合笼，次日晨将有阴栓的母鼠处死. 取输卵管在膨大部划出卵团，加透明质酸酶消化，挑出受精卵于M16继续培养4 h.　　在水平拉针仪（Model PN30）上将显微注射GD1管拉成注射针，注射针末端虹吸DNA溶液后，于400倍镜下注入受精卵雄原核. 　　注射后在M16继续培养2~4 h，挑选生长状态好的卵移卵，每只假孕鼠输卵管单侧移卵25~30枚. 注射的受精卵共存活657枚，移卵后产仔85只.  待小鼠3 wk后剪取鼠尾1 cm，加500 μL裂解液，50 μL蛋白酶K，56℃消化过夜. 离心，无水乙醇沉淀，700 mL/L乙醇洗涤，干燥后溶解于200 μL 纯水中，紫外分光光度计定量.
　
　　转基因阳性鼠. 反应条件： 95℃预变性5 min；94℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸3 min，35个循环；72℃延伸10 min.

 　　
　　Southern杂交： 选PCR阳性者，各取DNA 30 μL（约15 μg），用EcoRI消化，电泳，变性，中和，转膜，紫外交联，即可行杂交，探针为以显微注射用DNA为模板、以P1、P2为引物所获得的DSPP cDNA片段.
 
　　G0代整合小鼠每只一笼饲养，后与C57小鼠配种，雌性1∶1，雄性1∶2. F1代整合小鼠每系取雄性： 雌性1∶1~3合笼，F2代即可行纯合子鉴定. 建系同时对小鼠进行大体观察.

　　2结果

　　由于pBluescript空载体与含DSPP编码序列的片段大小相当，我们先用PvuI将载体切断，然后用NotI/SalI将含DSPP编码序列的片段切出，故电泳呈现3条带（Fig 1A）；克隆中，NotI/SalI切出3.0 kb及3.8 kb者为阳性（Fig 1B）；

　　PCR鉴定阴性者应当得到约1.8kb的片段，阳性者应当得到约1.0 kb的片段，85只小鼠中，符合此条件的为10只，号码为3, 7, 12, 21, 25, 26, 59, 63, 66, 75. Fig 2显示的是部分鉴定结果. 　　Fig 3显示的是Southern Blot鉴定结果. 按照设计，转基因阳性者应出现约3.0 kb的条带.  号码为3, 7, 21, 25, 26, 59的共6只小鼠确认为阳性. 一个整合阳性的G0代小鼠与C57小鼠交配产生后代，称为一个单系. 通过目前对转基因小鼠的大体观察，尚未发现明显表型异常.

　　3讨论
　　
　　牙本质涎磷蛋白（DSPP）可裂解为牙本质涎蛋白（DSP）和牙本质磷蛋白（DPP），是牙齿特异性蛋白.　　DSPP不仅仅表达于牙齿［3,4］. 而且在成釉细胞［5］、牙胚周围胚胎性网织骨和新生的软骨中［4］也有表达. 我们试图通过转基因的方法，建立一种DSPP功能研究的动物模型，选用了显微注射法制备转基因小鼠，是目前应用较为广泛的一种方法，其基本原理是用精细的显微注射针将外源基因直接注入动物受精卵的雄原核，使外源基因整合到基因组，从而获得转基因动物. 其优点是基因导入确实可靠，转移率较高，可导入的目的基因较长，DNA用量省，试验周期短.　　我们分别建立了两种小鼠系，即调控者（载体用pTeton质粒构建）［6］及受控者（载体用pTRE2质粒构建），本文所叙为后一种小鼠系的建立. 两种纯合的小鼠杂交产生的后代，其DSPP的表达时间、强度将取决于小鼠摄入四环素类物质的时间及摄入量. 这样，研究者就实现了对DSPP表达时间上的调控.

　　【】

　　［1］ 王捍国，肖明振，赵守亮，等. 永生化人成牙本质细胞样细胞系的建立［J］. 第四军医大学学报,2003;24(10):876-878.

　　Wang HG, Xiao MZ, Zhao SL, et al. Establishment of immortalized human odontoblastlike cell line ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(10):876-878.

　　［2］ 陆群，吴补领，周学东，等. 小鼠牙髓干细胞培养及诱导分化［J］. 第四军医大学学报,2003;24(18):1643-1646.

　　Lu Q, Wu BL, Zhou XZ, et al. Isolation, cultivation and differentiation of stem cells from mouse dental pulp ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24(18):1643-1646.

　　［3］ Qin C, Brunn JC, Cadena E, et al. The expression of dentin sialophosphoprotein gene in bone ［J］. J Dent Res, 2002 ;81(6):392-394.

　　［4］ 张蓉. 牙本质涎磷蛋白在牙齿发育、矿化及牙髓损伤修复中作用的研究［D］. 西安: 第四军医大学口腔医学院, 2001.

　　［5］ Papagerakis P, Berdal A, Mesbah M. Investigation of osteocalcin, osteonectin, and dentin sialophosphoprotein in developing human teeth ［J］. Bone, 2002 ;30(2):377-385.

　　［6］ 孙汉堂. 牙本质涎磷蛋白转基因小鼠模型的建立和相关研究［D］. 西安: 第四军医大学口腔医学院, 2003.