肝癌组织HCC
【关键词】 肝肿瘤
HCCX gene expression in hepatocarcinoma and NMR1H spectrum characteristics of correlative marker proteins
【Abstract】 AIM: To obtain the information expressed by HCCX mRNA in normal liver, parahepatic tissue and hepatocarcinoma with an information probe, catch the correlative protein spectrum characteristics of noncarcinomatous occupancy by the analytical technique of NMR1H spectra, and to discuss their rule and clinical value. METHODS: The obtained gene was labeled as a probe with u-12PDATP.The MTN blot diaphragm was hybridized with 32PHCCX and the function of genetic expression was detected with western blot. Parameter of a chemical shift of 19 kinds of monomeric amino acid (aa)was analyzed by the NMR1H spectrum apparatus. The Hand Book of ProtonNMR Spectra and Data was taken as the reference and analytic conditions were set up. RESULTS: The external clone formation experiment of BEL7402 transfected hepatocarcinoma cells showed that HCCX had a distinct inhibitory effect on the growth of them in vivo with low expression or without expression in hepatocarcinoma tissue and a significant difference as compared with normal tissue (P<0.01); and of the 19 kinds of monomer aa analyzed by NMR1H spectra, 14 were totally accorded with the spectra, 1 was similar, and Trp and His were obtained for the first time respectively. CONCLUSION: HCCX may be the pathogenic gene of hepatocarcinoma and highly homologous HFARP has an inhibitory effect on vascular endothelial cell apoptosis; The conditions of analyzing the correlative marker protein with NMR1H spectra can meet the demands of catching the information from the fingerprint region and provide a new method for the correlative study of physiopathologic mechanism.
【Keywords】 liver neoplasms; spectral science; gene; expression
【摘要】 目的：采用信息探针获取正常肝、肝旁组织和肝癌HCCX mRNA的表达信息；采用NMR1H谱分析技术捕获非癌性肝占位相关Pr谱学特征，探讨其和临床价值. 方法：将获得的全长基因用u12PDATP标记为探针，用32PHCCX杂交MTN blot膜片进行Western blot检测基因表达功能；用NMR1H谱仪分析19种单体氨基酸的化学位移等参数，以《Hand book of protonNMRspectra and Data》氨基酸图谱为参比，设置适宜的解析条件. 结果：转染BEL7402肝癌细胞的体外克隆形成实验表明，HCCX对其细胞在体内生长有明显抑制作用，在肝癌组织中为低表达或无表达，与正常组织比较有显著性差异P＜0.01；NMR1H分析19种单体aa，14种完全相符，1种相似，TrP和HiS分别为首次获得. 结论： HCCX可能是肝癌的致病基因，与其高度同源性的HFARP具有抑制血管内皮细胞凋亡的作用；NMR1H谱分析相关标志Pr的条件可满足指纹区信息捕获要求，为深入探讨病生机制相关研究提供新的方法学.
【关键词】 肝肿瘤；谱学；基因；表达
0引言
肝癌相关基因HCCX有完整的5′端和3′端，起始密码子ATC，翻译序列符合Kozak规则. NMR1H谱用于自旋量子I≠0的氨基酸单体分析，可获化学位移、偶合常数、峰面积多组参数. 我们用上两种方法对临床肝癌、肝结核患者的组织基因和血清蛋白进行了对比研究，现报告如下.
1材料和方法
1.1材料CDCL，不含氢，对实验无影响. 同时具有沸点低、溶解性好的优点. D2O：含氢量≥99%，用于重氢交换. SiCH4为内标，四甲基对称排列，比较稳定，不与氨基酸发生缔合，沸点仅为27℃，易于去除为其优点，［C6H5CD(CH3)2］用DCHL3来置换结构中的氢［C6H5CD(CH3)2］作为实验1；用邻二甲苯和对二甲苯以2∶1的比例混合，以观察波谱的线性和面积，作为实验对照2. Multiple tissue Northern(MTN) blot membrance为Chntech公司产品; DMEM，小牛血清，G18，Lipofect Amine Reagent为Cibco公司产品; 蛋白直接表达载体pET21a为Novogen公司产品；pCMVScript为Stratagene公司产品；核酸内切酶均为Promega公司产品;免疫组化试剂盒Envsion System kit (HRP)为Dako公司产品.动物实验在SPF级动物实验室进行. 细胞系BEL7402肝癌细胞由上海细胞所提供. BL21(DE3)宿主菌由院生物工程研究中心保存. ValieanZ 400核磁共振仪，美国生产，超导型，-273℃，电流、电阻均为零. 具实际可达0.1赫的高分辨率，灵敏度和线性理想. 以《Hand book of protonNMR spectra and Data》测定图谱为参比对照，确定被检品归属. 参比：19种单体氨基酸，L型12种，D型6种，B型1种，分别为LGLY，LATa，Lleu，Lser，LTYr，LArg，LMet，LTrp，LPro，LClu，LHis，LCYs，DAla，DLeu，DSer，DArg，DTrp，DHis，BAla，由Inova公司提供，作为试验参比. 从测定图谱与标准图谱对照吻合程度，以此界定实验分析的科学性、准确性和分辨精度. 经临床B超、CT, MRI像学和术后组织病理活检及AFP. SA确诊的肝癌26例，经抗酸染色、罗氏培养Bakete460及动物实验证实的占位性肝结核共17例，经肘前静脉取血，分离取上清酸化、提纯、冻干备用. 确立样本（参比实验和对照）分别用量5 mg，溶剂1 mL，常温常压条件下交换45 min，热水浴37℃，5 min. PW=5.8, PG=26, NS=36, SW＝4000 Hz，OL=3800条. 实验室25℃. ACE400NME持续100 μs强脉冲射频，所获得傅里叶变换信号经数字机求出NMR1H图谱.
1.2方法Northern blot将获得的全长基因HCCX用u12PDATP标记作为探针. 用32PHCCX探针杂交MTN blot膜片. 蛋白表达、抗体制备及Wesern blot设计引物并扩增. 扩增条件：95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2.5 min，300 cycles. 扩增产物为1.2 kb经Ndl+Sal酶切，分别克隆于直接表达载体pET32a(Novegen)上，表达质粒转化入BEL21DE3宿主菌进行表达. 采用NiNTAresin(Qiagen)在变性条件下纯化trxAHCCX和空载体的BEL7402细胞的细胞裂解液经定量后各取20 μg；上样SDSPAGE蛋白电泳，同蛋白印迹转移至硝酸纤维素膜，以免抗HCCX和多克隆载体（1∶1000稀释）作为一抗，以过氧化物酶标记的小鼠抗兔mAb作为二抗（1∶100稀释），进行Western blot检测分析［1,2］.
1.2.1克隆形成BEL7402肝癌细胞于50 mL・L-1 CO2条件 ,37℃培养DEME中,接种2×105的BEL7402肝癌细胞,24 h后用脂质体法转染以终浓度800 mg・L-1的G418筛选,至非转染对照细胞全部死亡后,弃去G418的培养液,用PBS清洗细胞6次,40 g・L-1中性缓冲甲醛固定,Giermsa染色、. 将6 wk龄BALB/c裸小鼠随机分为2组，每组6只. 一组为实验组，每只小鼠前驱体侧皮下接种转染pCMVScriptHCCX的Bel7402细胞2×106；另一组为对照组，用同样方法接种转染pCMVScript. 4 wk后处死小鼠并取其肿瘤组织称质量.
1.2.2免疫组化5 μm厚连续石蜡切片，HE染色进行普通病理组织学观察及肝癌组织的病理分级；用急抗HCCX多抗（1∶250稀释）作为一抗，Envision system kit, DBA显色，Mayer苏木素复染核，进行免疫组化，检测该基因在人正常肝、癌旁肝及肝癌组织中的表达［3］.
2结果
2.1基因表达功能HCCX在直接表达载体pET21a中不表达，经trxA融合后的有效表达，表达产物Mr 58 000，以包涵体的形式存在于细胞中. Western blot实验显示，抗血清效价为1∶100 000. HCCX mRNA在人胎盘组织中高表达，在心、肝、骨骼肌、胰腺、肺等脏器中度表达，在脑及肾组织中表达很低. HCCX在正常肝、肝癌和癌旁组织中，表达存在明显差异：在正常肝组织和癌旁肝组织中，HCCX均高表达，为96.8％，而在大多数肝癌组织中低表达，占71.0％，有的肝癌中甚至不表达，占19.4％，与李郁等［4］报道结果相近.
2.2NMR信息表达特征氢NMR波谱以《Hand book of protonNMR spectra and Data》相应氨基酸图谱为参比，进行对照解谱. 参比结果有14种相符合，分别为：LGly，LAla, DAla, BAla，LLeu, DLeu，LSer, DSer，LTyr，LGlu，LCys，BArg，LArg, LPro. 一种相似为LMet. DTrp, LTrp, LHis, DHis共4种的NMR谱信息为首次获得，14种谱图信息完全相符，其中尤以LAla，DAla，LLeu，DLeu，LSer，LPro 6种氨基酸的结果最为理想.
2.3肝癌肝结核谱图表达信息17例肝结核患者的血清蛋白NMR1H谱图出现特征峰，表现在化学位移(4.60±0.02)×10-6处，有15例强表达，2例弱表达. 所获多组信息数据的处理、析谱解图、结构确定和修正，由专用计算机和Xplor软件完成，得知有一官能团CCH. 26例肝癌患者血清蛋白NMR1H谱图特征峰，仅1例弱表达，余25例无表达，与前者相比差异有高度统计学意义（P＜0.01）.
3讨论
用脂质体法将HCCX转染BEL7402肝癌细胞的体外克隆形成试验表明，HCCX对肝癌细胞系的克隆形成有明显抑制作用，抑制率为58.3％（P<0.01）. Western blot转染pCMVScriptHCCX的BEL7402细胞在Mr 60 000位置处具有蛋白条带，而转染空载体pCMVScript的同种细胞未见该条带. 与国外学者Hui等的研究结果相近［5］. HCCX 体内抑瘤作用: 转染pCMVScript HCCX和空载体pCMVScript的BEL7402细胞的裸小鼠内成瘤平均质量分别为(0.24±0.10) g和(0.45±0.14) g (P<0.01),表明HCCX对BEL7402细胞的体内生长有明显抑制作用.
临床上对肝癌与非肝癌性占位病变如肝脓肿、肝囊肿、肝包虫、肝结核等的鉴别诊断不太理想，需辅以更特异准确的标志蛋白分析. HCCX低表达肝癌患者血浆唾液酸水平多呈正常值上限，而无HCCX表达的肝癌患者血浆唾液酸水平则明显升高(P<0.01),甲胎蛋白（AFP）作为原发肝癌标志物具有显著的临床诊断价值，血浆蛋白结合唾液酸（TPSA）作为恶性肿瘤标志物，在“广谱”和“早期发现”更显优势. HCCX可能是肝癌的致病基因，与其高度同源性的HFARP具有抑制血管内皮细胞凋亡的作用［6］；NMR1H谱分析相关标志Pr的条件可满足指纹区信息捕获要求，为深入探讨病生机制相关研究提供新的方法学. 原发性肝细胞癌（HCC）是世界范围内流行率及死亡率都很高的肿瘤之一［7］，将二种标志蛋白进行联合检测后用于肝癌的诊断，可有效避免假阳性，对占位性的结核病与肿瘤的鉴别诊断提供了全新的检测平台，有效提高诊断效率.
【】
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