氟美松对急性肝损伤大鼠肝细胞FasFas配体表达和细胞凋亡的影响
【关键词】 氟美松
Effects of dexamethasone on Fas/Fas ligand expression and apoptosis of hepatocytes in rats with LPSinduced acute liver injury
【Abstract】 AIM: To investigate the changes of expression of hepatocytes apoptosis and Fas/Fas ligand (FasL) in lipopolysaccharide (LPS)induced acute liver injury in rats and the effects of treatment by dexamethasone and to evaluate the potential role and mechanism in the pathogenesis of acute liver injury. METHODS: Expression of Fas/FasL protein and mRNA was detected using immunohistochemistry and in situ hybridization, respectively. Apoptosis was determined by terminal UTP nick end labelling (TUNEL) in rats during every phase of acute liver injury. RESULTS: Expression of Fas/FasL protein and mRNA was upregulated and correlated with the increased apoptosis in hepatocytes of rats with lipopolysaccharide (LPS)induced acute liver injury (P<0.05). The administration of dexamethasone suppressed apoptosis as well as expression of Fas/FasL protein and mRNA (P<0.05). CONCLUSION: Dysregulation of apoptosis and activation of Fas/FasL system may play a key role in the pathogenesis of LPSinduced acute liver injury in rats, which worsens the early stage acute liver injury. The protective effects of dexamethasone may obstruct the activation of Fas/FasL system and apoptosis of hepatocytes in rats with LPSinduced acute liver injury and thus alleviate liver damage.
【Keywords】 dexamethasone; LPS; liver injury; Fas/FasL; apoptosis
【摘要】 目的: 观察内毒素急性肝损伤后肝细胞凋亡和Fas/Fas配体（FasL）表达的变化，以及氟美松对其影响，探讨急性肝损伤早期作用机制. 方法: 采用免疫组化和原位杂交技术检测各时相点肝细胞Fas/FasL蛋白和mRNA的表达；应用原位末端标记技术对各时相点肝细胞凋亡进行检测. 结果: 内毒素急性肝损伤各时相点大鼠肝细胞Fas/FasL蛋白和mRNA的表达较对照组明显上调（P<0.05），且与肝细胞凋亡的增加相一致；氟美松可明显减轻炎症反应，抑制脂多糖（LPS）诱导的肝细胞凋亡，并使肝细胞Fas/FasL蛋白和mRNA的表达明显下调（P<0.05）. 结论: 肝细胞凋亡和Fas/FasL系统活化可能参与内毒素急性肝损伤早期的发病机制，而且加重早期肝损伤；氟美松可抑制Fas/FasL系统活化，阻断和调控凋亡，从而减轻肝组织损伤.
【关键词】 氟美松；内毒素；肝损伤；Fas/Fas配体；凋亡
0引言
急性肝损伤常与脓毒症和感染相关，内毒素急性肝损伤模型是模拟感染性肝损伤病因的一种模型，临床上较常见，内毒素的主要毒性成分是脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），内毒素结合蛋白即脂多糖结合蛋白主要由肝细胞合成并分泌，LPS可通过直接和间接效应导致肝脏和全身脏器的损伤［1-3］. 我们通过观察氟美松对内毒素急性肝损伤大鼠肝细胞Fas/Fas配体（Fas/Fas ligand, FasL）表达及细胞凋亡的影响，探讨其在全身炎症反应及急性肝损伤中的作用机制及意义.
1材料和方法
1.1材料雄性Wistar大鼠66只，体质量180~250 g，经10 g・L-1戊巴比妥钠麻醉后，随机分成3组：内毒素急性肝损伤组,尾静脉注射LPS 5 mg・kg-1，注射LPS后1,2,4,6和8 h活杀;氟美松组,在注射LPS 5 mg・kg-1同时尾静脉注射氟美松10 mg・kg-1，于注射后1,2,4,6和8 h活杀;正常对照组,尾静脉注射生理盐水0.1 mL，于注射后6 h活杀. 每个时相点为6只大鼠. 活杀后取肝组织观察Fas/FasL表达及细胞凋亡.
1.2方法肝细胞凋亡原位检测采用TUNEL法，按BM公司试剂盒提供方法稍加改进. 免疫组化Fas/FasL检测采用SP法，兔抗Fas多克隆抗体，兔抗FasL多克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司. Fas/FasL mRNA原位杂交检测：Fas/FasL寡核苷酸探针由院上海生物工程研究中心合成，序列如下：Fas 5′CTG TTT CAG GAT TTA AGG TTG GAG ATT3′, FasL 5′ CTT CAC TCC AGA AAG CAG GAC3′，按试剂盒提供方法进行标记，标记后探针质量及特异性按BM公司提供方法进行检测，均符合要求. 结果判断标准：①肝细胞凋亡：阳性细胞为核呈棕黄色显色，阴性细胞为核无棕黄色显色，5个高倍视野（×400）下的凋亡的细胞数，凋亡指数以凋亡细胞/100个细胞表示;②Fas/FasL蛋白质表达判断：阴性细胞的胞质或(和)胞膜均无棕黄色染色，阳性细胞的胞质或(和)胞膜棕黄色染色，阳性程度分为4级：0级为低倍镜视野阳性细胞偶见，1级为阳性细胞小于1/3，2级为阳性细胞为1/3~2/3，3级为阳性细胞大于2/3；③Fas /FasL mRNA原位杂交结果判断；阳性细胞的胞质或胞核呈紫蓝色染色，阴性细胞无紫蓝色染色，分级程度同②.
统计学处理：凋亡指数以x±s表示，组内各时相点比较用t检验，同一时相点组间比较用方差分析，采用SPSS 10.0处理.
2结果
2.1肝细胞凋亡Fas/FasL蛋白表达免疫组化结果提示，氟美松治疗组Fas/FasL蛋白质表达的明显减弱(Tab 1)，与对照组表达水平相近.
表1急性肝损伤大鼠Fas/FasL蛋白的表达 (略)
2.2肝细胞Fas/FasL mRNA的表达原位杂交结果表明，氟美松冶疗组6 h时相点的Fas/FasL mRNA表达水平明显低于急性肝损伤组6 h时相点(Tab 2).
2.3肝细胞凋亡的检测与急性肝损伤组相比，氟美松治疗组大鼠肝细胞凋亡明显减少(Tab 3).
表2急性肝损伤大鼠6 h Fas/FasL mRNA的表达 (略)
表3急性肝损伤大鼠肝细胞凋亡指数 (略)
3讨论
我们采用尾静脉注射LPS方法复制肝损伤，谷氨酰转氨酶呈上升趋势，病理观察肝细胞肿胀，肝组织结构紊乱，肝窦扩张、充血或消失，中央静脉区充血，部分肝组织点状坏死，说明以LPS 5 mg・kg-1尾静脉注射可造成肝组织急性损伤［2,3］. 我们采用电镜和TUNEL法对急性肝损伤大鼠肝组织细胞凋亡进行检测，结果发现大鼠注射LPS 1 h以后即可见肝细胞及窦状腺内皮细胞有凋亡改变，标记的阳性细胞呈散在的点状分布或小灶状分布，并随时间延长凋亡呈上升趋势，而对照组未见上述细胞凋亡改变，提示肝细胞凋亡是肝损伤的早期现象，细胞凋亡存在急性肝损伤病程中，细胞凋亡可能参与急性肝损伤早期窦状腺内皮细胞和肝细胞受损，加重肝组织损害，肝细胞凋亡与坏死同时存在可能是导致肝功能减退的主要原因之一［4-6］.
近来研究认为，Fas/FasL系统功能失调是一些疾病的重要发病机制之一［7-10］. 本组原位杂交结果显示，对照组Fas mRNA 仅见微弱表达，而FasL mRNA未见表达，注射LPS后Fas mRNA, FasL mRNA表达明显增加. 免疫组化结果发现，Fas在内毒素急性肝损伤大鼠肝组织表达明显增加，且呈弥漫性，FasL抗原表达也有一定程度上调，两者均以中央静脉及炎性浸润周围的肝细胞明显，且肝损伤时肝组织Fas/FasL表达增加与肝细胞凋亡的增加相一致. 以上结果提示细胞凋亡及相关基因表达异常可能参与内毒素急性肝损伤的发病机制.
近来研究表明，糖皮质激素对LPS诱导大鼠急性肝损作有明显防护作用，与抑制肿瘤坏死因子、白细胞介素1β及白细胞介素8等炎性细胞因子表达有关. 研究结果表明，氟美松可抑制肝脏炎症反应及肝细胞、内皮细胞凋亡［11-13］. 证实了糖皮质激素可调控肝组织细胞凋亡. 本结果显示，大鼠在给予LPS同时予以氟美松可明显抑制肝脏炎症反应. 氟美松在病程早期（<8 h）可明显抑制LPS诱导的肝细胞凋亡，并明显下调Fas/FasL mRNA及蛋白质的表达，氟美松抑制急性肝损伤早期肝细胞凋亡，保护肝组织的机制可能与以下因素有关：①抑制炎性介质的释放，减轻肝组织损伤；②抑制肝细胞凋亡及Fas/FasL系统的活化. 本结果表明，氟美松组大鼠肝组织Fas/FasL表达较内毒素急性肝损伤组显著降低，接近完全抑制，而肝组织损伤和靶细胞凋亡也明显减轻，说明氟美松可通过抑制Fas/FasL系统活化而阻断和调控肝组织靶细胞凋亡.
【】
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