心肌缺血再灌注时Gsα和Giα蛋白含量mRNA水平变化及意义

         作者：钟前进，汪曾炜，肖颖彬

【关键词】  心肌缺血

    Changes and significance of levels of Gsα and Giα and their mRNA in myocardium undergoing ischemic reperfusion

　　【Abstract】   AIM:   To study the changes of the levels of α subunits of stimulatory (Gsα) and inhibitory  (Giα)  guanine nucleotidebinding protein  and their mRNA in newborn guineapig myocardium undergoing global ischemic reperfusion and to explore the relation between these changes and cardiac functions. METHODS:  Thirty newborn guineapigs were randomly assigned to three groups (n=10 in each group) and isolated perfused working heart models were established. The newborn hearts suffered global ischemia alone for 90 min  in groupⅠ, arrested by St. Thomas Hospital cardioplegic solution Ⅱsimultaneously in group Ⅱ and arrested by cold blood cardioplegia simultaneously in group Ⅲ. All the hearts were reperfused for 60 min. Cardiac functions and the levels of Gsα and Giα and their mRNA were investigated. RESULTS:  The cardiac functions were markedly deteriorated in group Ⅰand group Ⅱ during reperfusion (P<0.01), whereas no pronounced changes of cardiac functions  were found at the end of reperfusion in group Ⅲ (P>0.05). Significant decreases of the levels of Gsα and its mRNA (P<0.01) and notable increases of levels of Giα and its mRNA (P<0.01) were found in group Ⅰand group Ⅱ after ischemia and after reperfusion when compared with those before ischemia and in group Ⅲ, but recovery to the levels of Gsα and Giα and their mRNA before ischemia was achieved in group Ⅲ after reperfusion (P>0.05 vs before ischemia). CONCLUSION:  Ischemic reperfusion injury of immature guinea pig myocardium may result from the unbalance between Gsα and Giα.

　　【Keywords】    myocardial ischemia; myocardial reperfusion injury; GTPbinding proteins; cardioplegic solutions; guineapigs

　　【摘要】 目的：研究新生豚鼠心肌缺血再灌注时Gsα和Giα蛋白含量及其mRNA水平的变化以及与心功能变化的关系. 方法： 30只新生豚鼠随机分为3组（每组n=10），建立离体心脏左心做功模型. 组Ⅰ： 离体心脏缺血90 min；组Ⅱ：缺血时予Thomas Ⅱ号液；组Ⅲ：缺血时予冷血心停搏液. 各组均再灌注60 min. 检测心功能指标，Gsα和Giα蛋白含量及其mRNA水平的变化. 结果： 组Ⅰ和组Ⅱ在再灌注时的心功能明显受损（P<0.01），组Ⅲ在再灌注结束时无明显变化（P>0.05）. 组Ⅰ和组Ⅱ在缺血后和再灌注后Gsα蛋白含量分别为缺血前的37.5%, 40.3%, 36.6%和39.5%，Gsα mRNA水平分别为缺血前的38.6%, 41.4%, 35.7%和40.1%，明显降低(P<0.01)；Giα蛋白含量分别为缺血前的198.1%, 175.4%, 201.3%, 181.4%，Gi2α mRNA水平分别为缺血前的215.4%, 180.2%, 210.3%和176.2%，显著升高(P<0.01). 组Ⅲ在再灌注后Gsα和Giα蛋白含量及其mRNA恢复至缺血前的水平（P>0.05）. 结论： Gsα和Giα蛋白的平衡遭受破坏可能是未成熟心肌缺血再灌注损伤发生的机制之一.

　　【关键词】    心肌缺血；心肌再灌注损伤；GTP结合蛋白质类；心麻痹液；豚鼠

　　0引言

　　鸟嘌呤核苷酸偶联蛋白(G蛋白)在细胞信号转导过程中起着“电话交换机(switchboard)样”作用［1］，与心脏病理生理过程密切相关［2］. 对心肌缺血再灌注过程中G蛋白变化的研究有益于增强对心肌缺血再灌注损伤的认识，是一值得探讨的课题. 有关未成熟心肌缺血再灌注时兴奋性鸟核苷藕联蛋白α亚基(Gsα)和抑制性蛋白α亚基(Giα)蛋白含量的变化及其mRNA水平的变化鲜见研究报道［3］，我们拟以新生豚鼠为研究对象，利用离体工作心脏模型，运用Western印迹分析和Northern印迹分析等方法对此进行研究.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　①   实验分组和模型：0~2 d龄新生豚鼠，雌雄不拘，体质量50~80 g. 实验随机分为3组（每组n=10）. 建立离体心脏顺灌左心做功模型［4］： 取豚鼠心脏,将主动脉断端套于主动脉插管上，行Langendorff逆灌，灌注液为KH液，心脏复跳. 行左房插管,停止逆灌，经左房顺行灌注. 停止顺灌，Ⅰ组（低温组）于20℃全心缺血90 min，Ⅱ组(Thomas组)和Ⅲ组（冷血组）在缺血开始、第30 min和第60 min时经主动脉分别逆灌10℃ Thomas Ⅱ号液和冷血心停搏液. 之后，三组均给予37℃氧合KH液逆灌，使心脏复跳，尔后再灌60 min.  ② 抗体和cDNA探针  RM/1Gs蛋白多克隆抗体和AS/7 Gi蛋白多克隆抗体（美国NEN公司）；大鼠Gsα和Gi2α cDNA探针（美国NEN公司），长度分别为1737 bp和1748 bp.

　　1.2方法

　　1.2.1心功能指标测定在缺血前和再灌注15， 30， 45和60 min时，将左心室测压管连接于MPAIV型多导生物信号分析系统（第二军医大学生教研室研制），测定各组左室收缩峰压（LVPSP）、左室舒张末压（LVEDP）、左室内压正负相最大变化速率（±dp/dtmax）、心输出量（CO）.

　　1.2.2Western 印迹分析将冷冻心肌组织置于4℃预冷的含1 mol/L MgCl2， 25 mol/L三（羟甲基）氨甲烷/盐酸（Tris/HCl），0.4  mol/L甲苯磺酰氟（PMASF， Sigma公司）和1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）的心肌匀浆液中，匀浆制备膜蛋白，-70℃贮存备用. 120 g/L十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），每一样品上样75 μg，以电转移的方式转移至硝酸纤维素膜上. 将膜封闭后，与抗Gs（按滴度1∶1000）和抗Gi（按滴度1∶1000）反应1 h，洗去抗体后将膜置于1∶500的碱性磷酸酶标记的IgG中反应1 h，Tris缓冲盐溶液（TBS）充分洗涤，以NBT（氮蓝四唑）+BCIP（5溴4氯3吲哚磷酸）显色，最后摄片记录.

　　1.2.3Northern印迹分析以Trizol液提取心肌总RNA，用紫外分光光度法测定并其浓度和纯度（A260 nm/A280 nm>1.80），将RNA样品上样至10 g/L变性琼脂糖胶上电泳，毛吸法转移至硝酸纤维素膜上，80℃真空烘干. 硝酸纤维素膜50℃杂交过夜后，在预杂交液中加入50 mg/L鲑鱼精DNA和32P标记的cDNA探针（2×108cpm/μg），50℃杂交过夜. -70℃放射自显影，最后对X胶片进行扫描分析. βactin cDNA作为内参照.

　　1.2.4mRNA和蛋白质含量的确定Western 印迹分析的结果用测得的目标带的吸光度×面积表示，尔后按占缺血前的百分比进行统计. Northern 印迹分析则将所测值用内参照βactin校正后再按占缺血前的百分比进行统计分析.

　　统计学处理： 各组以缺血前值为100%，并计算缺血后和再灌注后实测值分别与缺血前值的百分率. 数值以x±s表示，用重复测量方差分析进行统计处理，P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1心脏功能的变化再灌注时，Ⅰ组和Ⅱ组的LVPSP,  +dp/dtmax,    -dp/dtmax和CO在各时相点均显著降低，而 LVEDP显著升高（P<0.01）；Ⅲ组在再灌注60 min时各心功能指标均恢复至与缺血前相当的水平（P>0.05）；Ⅰ组和Ⅱ组的LVPSP, +dp/dtmax, -dp/dtmax和CO在各时相点均显著低于，而 LVEDP显著高于Ⅲ组（P<0.01, Tab 1). 表1新生豚鼠心脏功能缺血前和再灌注时的变化（略）

　　2.2心肌Gsα蛋白和Giα蛋白含量的变化三组缺血前的Gsα和Giα蛋白水平无明显差异（P>0.05）. 缺血后，Ⅰ组和Ⅱ组Gsα蛋白水平显著低于缺血前(P<0.01)，Giα蛋白水平显著高于缺血前和Ⅲ组（P<0.01），两组之间尚无明显差异（P>0.05）；再灌注后，Ⅲ组的Gsα和Giα蛋白水平与缺血前无明显差异（P>0.05），且分别明显高于和低于Ⅰ组和Ⅱ组（P<0.01, Tab 2）. Gsα蛋白呈现出Mr 45×103和52×103两条蛋白带，Giα蛋白呈现出一Mr 41×103蛋白带(Fig 1). 表2新生豚鼠心肌Gsα蛋白和Giα蛋白的变化（略）

　　2.3心肌Gsα mRNA和Gi2α mRNA水平的变化三组缺血前的Gsα mRNA和Gi2α mRNA水平无明显差异(P>0.05). 缺血后，Ⅰ组和Ⅱ组的Gsα mRNA和Gi2α mRNA水平明显低于和高于缺血前和Ⅲ组（P<0.01）. 再灌注后，Ⅲ组Gsα mRNA和Gi2α mRNA水平与缺血前无明显差异(P>0.05)，且分别明显高于和低于Ⅰ组和Ⅱ组（P<0.01, Fig 2, Tab 3).表3新生豚鼠心肌Gsα mRNA和Gi2α mRNA的变化（略）

　　3讨论

　　心肌缺血再灌注损伤及其保护一直受到重视［5，6］. G蛋白作为细胞信号转导过程中的“电话交换机（switchboard）”［4］，在许多心肌病理过程中发挥作用［5］. 未成熟心肌缺血再灌注时G蛋白的变化鲜见研究报道［6］. 本组研究结果显示，Ⅰ组心肌缺血后的Gsα蛋白水平明显降低，再灌注后Gsα蛋白量虽有所恢复，仍明显低于缺血前. GsαmRNA的表达与Gsα蛋白含量的变化平行. 缺血后Gi2α mRNA水平升高，再灌注后虽有所下降，仍明显高于缺血前，并由此引起Giα蛋白量在缺血后和再灌注后的升高. 由此推测，Gs和Gi的平衡遭受破坏是未成熟心肌缺血再灌注损伤发生的机制之一.

　　Thomas Ⅱ号液对未成熟心肌缺血再灌注损伤的作用尚有争议［7］，冷血心停搏液对成熟和未成熟心肌均具良好保护作用［8］. 本结果提示，Ⅱ组缺血再灌注后的Gsα mRNA水平和Gsα蛋白含量明显降低，而Gi2α mRNA水平和Giα蛋白含量显著增加. Ⅲ组缺血后Gsα mRNA和Gsα以及Gi2α mRNA和Giα蛋白水平虽有变化，但在再灌注后恢复至与缺血前相当的水平. 可见，Thomas Ⅱ液对未成熟心肌缺血再灌注无有效保护可能是由于该液失于对未成熟豚鼠心肌细胞G蛋白的保护，冷血心停搏液对未成熟豚鼠心肌的保护作用与其对G蛋白的保护有着密切的关系. 这从另一个角度说明了Thomas Ⅱ液和冷血心停搏液的不同心肌保护作用的可能机制.

　　【】
 
　　［1］Neer EJ. Heterotrimeric G protein: Organizers of transmembrane signals ［J］. Cell, 1995；80(2): 249-257.

　　［2］ Booz GW, Day JN, Baker KM. Interplay between the cardiac renin angiotensin system and JAKSTAT signaling: Role in cardiachypertrophy, ischemia/reperfusion dysfunction, and heart failure ［J］.J Mol Cell Cardiol, 2002；34(11): 1443-1453.

　　［3］Boraso A, Ceconi C, Cargnoni A, et al. Betaadrenergic receptors and intracellular signalling pathway in stunned and nonischemic regionsof pig myocardium ［J］. Basic Res Cadiol, 2001(4)；96: 388-394.

　　［4］ 钟前进,刘欲团,曹新来,等. 新生豚鼠离体心脏顺灌左心做功模型的建立［J］. 病理生理杂志,1999；15(2): 191-192.

　　Zhong QJ, Liu YT, Cao XL, et al. Establishment of model of isolated perfused leftside working heart from newborn guineapig  ［J］. Chin J Pathophysiol, 1999；15(2): 191-192.

　　［5］马兰香,贾国良,张清,等. 高、低剂量极化液对缺血/再灌注心肌保护作用的对比研究［J］. 第四军医大学学报,2003;24(22): 2087-2090.

　　Ma LX, Jia GL, Zhang Q, et al. Comparative study on myocardial protection by high dose GIK and low dose GIK during myocardial ischemia and reperfusion ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24(22): 2087-2090.

　　［6］赵建洪,程彦斌,张正义,等. 吗啡对大鼠急性心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其对心肌细胞凋亡的影响［J］. 第四军医大学学报,2004;25(16): 1460-1463.

　　Zhao JH, Chen YB, Zhang ZY, et al. Protective effects of morphine on acute myocardial ischemiareperfusion injury in rat and its influence on apoptosis of cardiomyocytes ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2004;25(16): 1460-1463.

　　［7］ Wang J, Zhou X, Zhao Y, et al. Myocardial protection of immature rabbits:polarizing versus depolarizing ［J］. J Surg Res, 2003;111(1):1-7.

　　［8］ Louagie YA, Jamart J, Gonzalez M, et al. Continuous cold blood cardioplegia improves myocardial protection: A prospective randomized study ［J］. Ann Thorac Surg, 2004；77(2): 664-671.