结核分枝杆菌Rv2450c基因的克隆和原核表达

            作者：李立青，苏明权，李立文，郝晓柯

【关键词】  分枝杆菌

    Cloning and prokaryotic expression of Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene

　　【Abstract】 AIM: To explore whether the Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene   can promote its own resuscitation and growth. METHODS:  Mycobacterium tuberculosis was cultured and genome DNA was extracted. Rv2450c gene was obtained by PCR using specific primers, cloned into BamHⅠ and EcoRⅠ site of pGEX4T2 expression vector and confirmed by sequencing. After the recombinant expression vector being transformed into E.coli BL21（DE3）, the recombinant bacteria were induced at 30℃ for 5 h and the fusion protein GSTRv2450c was analyzed by SDSPAGE. RESULTS:  DNA sequencing results showed that the Rv2450c gene amplified was exactly consistent with the sequence reported in GenBank and the SDSPAGE analysis demonstrated that the Rv2450c was expressed in E.coli BL21（DE3）. The protein band amounted to 22.9% of total bacteria protein．CONCLUSION:  Mycobacterium tuberculosis Rv2450c gene is successfully cloned and expressed in E.coli BL21（DE3）.

　　【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; resuscitationpromoting factor; cloning, molecular; gene expression

　　【摘要】 目的： 研究结核分枝杆菌Rv2450c基因是否能促进其复活和生长. 方法： 培养结核分枝杆菌，提取其基因组，PCR扩增出Rv2450c基因，克隆入pSP73载体，测序分析. 将该目的基因亚克隆入pGEX4T2表达载体，测序证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3），30℃用IPTG诱导5 h然后进行SDSPAGE分析. 结果： 测序结果证实获得了Rv2450c基因，其序列与GenBank中报道完全一致. SDSPAGE分析表明，Rv2450c基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达了重组蛋白，表达的蛋白量约占菌体蛋白的22.9%. 结论： 成功克隆了结核分枝杆菌Rv2450c基因，并在大肠杆菌中获得了高效表达.
 
　　【关键词】 分枝杆菌，结核；促进复活因子；克隆，分子；基因表达

　　0引言

　　目前世界人口的三分之一被结核分枝杆菌感染，其中大部分为潜伏性感染，当机体抵抗力下降时，休眠的结核分枝杆菌即活化，引发结核病. 在这个过程中结核分枝杆菌分泌的促进复活因子（resuscitationpromoting factor, RPF）起了重要作用，但其具体机制还不清楚［1，2］. 结核分枝杆菌H37Rv基因序列中Rv0867, Rv1009, Rv1884c,  Rv2389c和Rv2450c基因均编码RPF样蛋白，它们同源性很高，是Mr约为16 000的分泌蛋白. 我们克隆表达了Rv2450c基因，为进一步研究其活性奠定了基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　大肠杆菌TOP10，BL21（DE3）为第四军医大学西京检验科保存；原核表达载体pGEX4T2购自Pharmacia公司；质粒提取试剂盒购自Sigma公司；克隆载体pSP73、胶回收试剂盒购自Promega公司；BamHⅠ, EcoRⅠ等限制性内切酶和Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、IPTG等购自Takara公司.

　　1.2方法

　　1.2.1PCR引物设计根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列（登录号： NC_000962），设计引物，上游引物为 5′GAA AGG ATC CAC GAT GAA GAA CGC CCG TAC3′，下游引物为 5′TTT GAA TTC TTT TGC GTC TTT TCG CGG TGG TCA G3′，在上、下游引物 5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和3个保护碱基，以便于酶切和克隆，引物由上海生工生物工程有限公司合成.

　　1.2.2结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA的提取刮取适量H37Rv菌落，TE（pH 8.0）洗涤后重悬，加SDS至终浓度10 g/L，蛋白酶K至终浓度0.1 g/L, 55～60℃水浴过夜，分别用等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、氯仿：异戊醇（24∶1）各抽提1次，上层水相加2.5倍预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L乙酸钠后置-20℃冰浴1 h沉淀DNA，用无水乙醇、700 mL/L乙醇先后洗涤沉淀2次，抽干后溶于适量ddH2O中.

　　1.2.3Rv2450c基因扩增及克隆和鉴定以H37Rv基因组DNA为模板用Pyrobest DNA聚合酶进行热启动PCR，循环参数为94℃变性60 s，55℃退火60 s，72℃延伸60 s，30个循环后再72℃延伸10 min. 12 g/L琼脂糖凝胶电泳观察分析扩增结果，切胶、用胶回收试剂盒纯化DNA，进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，用T4连接酶连接，插入pSP73克隆载体，转化感受态大肠杆菌TOP10，挑取生长状态良好的菌落接种含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基，次日提取质粒DNA，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定，将获得的阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，得到的正确重组质粒命名为pSP73Rv2450c.

　　1.2.4Rv2450c基因原核表达载体的构建和鉴定将质粒pSP73Rv2450c用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，所获得的片断亚克隆到经同样双酶切的载体pGEX4T2中，得到的重组表达质粒转化感受态大肠杆菌BL21（DE3），经氨苄青霉素筛选，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司进行测序，正确的重组质粒命名为pGEX4T2Rv2450c.

　　1.2.5GSTRv2450c融合蛋白的诱导表达将含正确重组质粒pGEX4T2Rv2450c的大肠杆菌BL21（DE3）37℃过夜增菌，次日取适量菌液用含100 mg/L氨苄青霉素的LB培养基进行1∶100稀释，37℃, 220 r/min的条件下培养. 以不同的温度，不同的诱导前菌浓度（A600 nm＝0.1, 0.3, 0.6, 0.8, 1.0），不同的IPTG终浓度（0.1, 0.2, 0.3, 0.5, 0.8, 1.0 mmol/L）和不同的时间（3, 4, 5, 6 h）诱导重组蛋白表达. 在4℃, 5000  g条件下离心集菌，将上清、沉淀和菌体分别行120 g/L SDSPAGE. 电泳结束后，用考马斯亮蓝R250染液染色，在脱色液中脱色2 h后观察分析结果.

　　2结果

　　2.1Rv2450c基因序列的获得与鉴定经热启动PCR获得一条约为562 bp大小的特异性条带，与预期目标片段大小相等（Fig 1）.

　　2.2pGEX4T2Rv2450c的双酶切鉴定及测序酶切后琼脂糖凝胶电泳显示出现了4960 bp的载体片段和约562 bp的目的基因片段，测序后证实其序列与GenBank中所给序列完全相同（Fig 2）.

　　2.3pGEX4T2Rv2450c的诱导表达将鉴定正确的阳性克隆株在不同条件下进行诱导表达，120 g/L SDSPAGE分析结果发现，经诱导后表达Mr约44 000的外源蛋白，与预期大小一致. 在30℃, A600 nm值为0.6, IPTG终浓度为0.3 mmol/L、诱导表达5 h后融合蛋白表达量较高，占菌体蛋白的22.9%，同时发现融合蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在（Fig 3）.

　　3讨论

　　结核分枝杆菌的5个RPF基因分散在整个基因组中，对刺激静息期细菌生长起重要作用，因此推测对宿主体内潜伏的结核分枝杆菌的复活起促进作用. 分别敲除结核分枝杆菌基因组中的某一个RPF基因时，其生长并没受到明显影响，说明这一蛋白家族的功能有一定重叠，不是结核分枝杆菌生长所必需的，但从对数生长期到停滞期它们的表达模式不同，在特定的感染期每个RPF基因的功能也不相同［1，3］. Rv2450c是唯一可被15 min酸冲击（acid shock）诱导的RPF基因，在它编码序列的氨基端有一个富含脯氨酸的区，使它成为免疫学上重要的分泌型抗原，可强烈刺激机体产生抗体及发生迟发型超敏反应［4，5］，研究意义重大，而国内RPF样蛋白的研究报道极少.

　　我们的研究扩增了结核分枝杆菌Rv2450c基因全长序列，并将其克隆入原核表达载体pGEX4T2. 表达载体pGEX4T2是GST融合表达载体，它含有强启动子tac及lac操纵基因、SD序列及lac阻遏蛋白基因等，是一种较为高效的蛋白表达载体. 而且在表达载体pGEX4T2 GST的下游有编码凝血酶识别位点的序列，高效表达的外源蛋白可用GSTrap FF亲和层析纯化，用凝血酶水解回收外源蛋白. 我们用IPTG诱导，在大肠杆菌BL21（DE3）中表达融合基因GSTRv2450c，SDSPAGE电泳显示，在装有外源基因表达载体的大肠杆菌中，出现了特异的Mr约44 000的融合蛋白，而GST处的蛋白质条带消失，仅含空载体的大肠杆菌在Mr 26 000处有GST蛋白的表达，证明了GSTRv2450c融合基因的表达.

　　原核表达中，重组蛋白常常以包涵体的形式表达，对包涵体进行变性、复性处理不仅操作繁琐，而且重组蛋白的活性也往往受到影响. 我们将诱导表达后的大肠杆菌超声裂解后，分别取上清、沉淀和菌体做SDSPAGE电泳，发现表达的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在，凝胶扫描分析确定表达的目的蛋白量占菌体蛋白的22.9%，因此我们获得了GSTRv2450c融合蛋白的高效表达，这与我们选用了最佳的表达载体和宿主菌及反复优化表达条件是分不开的，其可溶性蛋白为我们下一步大量纯化表达产物，分析其活性，进而深入研究Rv2450c蛋白的结构和功能奠定了基础.

　　【】

　　［1］ Tufariello JM, Jacobs WR Jr, Chan J. Individual Mycobacterium tuberculosis  resuscitationpromoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo ［J］. Infect Immun, 2004;72（1）:515-526.

　　［2］ 苏明权，李立文，张彩莲，等. 结核分枝杆菌Rv1009的生物信息学分析及克隆、表达［J］. 生物技术通讯，2003；14（6）：557-559.

　　Su MQ, Li LW, Zhang CL, et al. Bioinformatic analysis，clonging and expression of Rv1009 of  Mycobacterium tuberculosis ［J］. Lett in Biotechnol, 2003;14（6）:557-559.

　　［3］ Mukamolova  GV,  Kaprelyants AS,  Young DI, et al. A bacterial cytokine ［J］.  Proc Natl Acad Sci, 1998;95:8916-8921.
 
　　［4］ Manca  C,  Lyashchenko K,  Colangeli R, et al. MTC28, a novel 28kilodalton prolinerich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex ［J］. Infect Immun, 1997;65（12）:4951-4957.

　　［5］ Martin CG,  Philippe B,  Claire B, et al. The structure of a resuscitationpromoting factor domain from Mycobacterium tuberculosis shows homology to lysozymes ［J］. Nature Structure & Molecular Biology, 2005;12（3）:270-273.