补骨脂素加长波紫外线照射对白血病K562细胞的杀伤作用
【关键词】 补骨脂素
［摘要］ 目的：探讨补骨脂的提纯物补骨脂素（psoralen）加长波紫外线（ultravioletA light）照射光化学疗法，亦称PUVA（psoralen plus ultravioletA light）疗法，对慢性粒细胞白血病红白病变细胞株K562细胞的杀伤作用。方法：以传代培养的K562细胞为模型，采用四甲基偶氮唑盐比色法（monotetrazolium test, MTT）测定单纯补骨脂素、单纯紫外线照射及PUVA疗法对白血病细胞的杀伤作用；采用流式细胞仪对其进行DNA含量分析，并用早期凋亡试剂盒AnnexinⅤFITC和碘化丙啶（propidine iodide, PI）双染法测定单纯补骨脂素对白血病细胞的作用；采用电镜技术对其进行形态学观察。结果：单纯补骨脂素或单纯紫外线照射对K562细胞均有杀伤作用，PUVA比单纯补骨脂素或单纯紫外线照射对K562细胞的杀伤作用有明显增强（P＜0.05)。PUVA处理后的白血病细胞通过流式细胞仪可以检测到亚二倍体凋亡峰。电镜下可见：细胞体积变小，胞浆浓缩，胞核染色质聚集或边集，核小体碎裂，大部分细胞呈典型的凋亡形态。结论：中药补骨脂提纯物补骨脂素对人白血病细胞K562具有杀伤作用。补骨脂素具有光敏活性，结合360 nm波长紫外线照射对K562细胞的杀伤作用有明显增强。紫外线照射时间以10 min为最佳；补骨脂素适宜的终浓度为40 μg/ml。PUVA对人白血病细胞K562杀伤作用的机制主要是诱导细胞凋亡。
［关键词］ 补骨脂素; 光化学疗法; 白血病, 髓样, 慢性; K562细胞系; 细胞凋亡
ABSTRACT Objective: To observe the effects of psoralen plus ultravioletA light (PUVA) on K562 cells and the relative mechanism. Methods: The effects of psoralen, ultravioletA light and PUVA on K562 cells were assayed by monotetrazolium test (MTT). DNA content was analyzed by flow cytometry (FCM). The apoptotic rates of K562 cells treated with 40 and 80 μg/ml psoralen for 24 and 48 hours were assayed by AnnexinVFITC/PI reagent kit on FCM respectively. The ultrastructures of apoptotic cells were observed by a transmission electron microscope (TEM). Results: Either single psoralen therapy or single ultravioletA irradiation had inhibiting effect on K562 cells. The inhibiting effect of PUVA on K562 cells was stronger than that of the single psoralen therapy or single ultravioletA light irradiation (P＜0.05). Apoptotic peak (AP) was detected by FCM. TEM test showed that K562 cells treated with PUVA were smaller, having condensed cell nucleus, assembled chromatin, disintegrated nucleus body and the majority of the cells appeared to be apoptotic conformation. Conclusion: Psoralen has inhibiting effect on K562 cells, and the effect of PUVA is more significant. It is suggested that 10 min irradiation and 40 μg/ml terminal concentration of psoralen be probably the best choice for PUVA. The inhibiting effect of PUVA is due to apoptosis.
KEY WORDS psoralen; photochemotherapy; leukemia, myeloid, chronic; K562 cell line; apoptosis
补骨脂素(psoralen)，又称呋喃香豆素，是中药补骨脂种子中的主要成分，具有明确的抑制肿瘤的作用，且具有光敏活性。补骨脂素加长波紫外线（psoralen plus ultravioletAlight, PUVA）的光化学疗法，在国内外主要用于治疗牛皮癣［1］、白斑病、皮肤T细胞淋巴瘤［2］等一些皮肤疾病。国内学者曾就PUVA疗法对白血病细胞的杀伤作用作了一些研究，但未见有相关的具体作用机制及影响因素的报道。为此，本实验研究了PUVA疗法对白血病细胞株K562杀伤作用的影响因素及其作用机制，并探讨其在临床方面的应用价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料与仪器 RPMI 1640培养液，美国GibcoBRL公司产品；小牛血清，杭州四季青生物材料工程公司产品；四氮唑蓝（monotetrazolium, MTT），美国Sigma公司产品；补骨脂素，大连理工大学提供；CO2细胞培养箱，美国Napco公司产品；Elx800自动酶标仪，美国BioTek公司产品；石英比色皿，宜兴市仪器仪表总厂产品；GLY10型光量子血液平衡治疗仪，徐州华卫医疗设备公司产品；体视显微镜，日本Olympus公司产品；流式细胞仪，美国BeckmanCoulter公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 将慢性粒细胞白血病红白病变细胞株K562细胞置于含10 %小牛血清、4万U/ml庆大霉素的RPMI 1640培养基中，在温度37 ℃和5 % CO2饱和湿度的培养箱中进行传代培养。
1.2.2 实验分组 根据长波紫外线照射时间，将实验组分为以下PUVA 4组：（1）0 min组，即对照组；（2）5 min组；（3）10 min组；（4）15 min组。每一组中又按补骨脂素浓度（0、10、20、40、80 μg/ml）分成5个浓度等级。
1.2.3 MTT法测定细胞杀伤作用 取对数生长期的K562细胞，充分混匀，台盼蓝染色计数，浓度调整为4.0×105/ml，取20个细胞培养瓶，分成4组，每组5瓶，每瓶中加入细胞悬液5 ml，分别加入补骨脂素0～80 μl，使补骨脂素的终浓度依次为0、10、20、40、80 μg /ml，在温度37℃及5 % CO2饱和湿度的培养箱中预孵1 h后放入石英比色皿中，在GLY10型光量子血液平衡治疗仪（λ= 360 nm）上按1 J/m2的辐射量边照射边震荡，然后用长波紫外线分别照射0、5、10和15 min。照射结束后，每瓶中取200 μl，接种于96孔板中，每孔设3个平行孔。经48 h后，加入MTT贮存液（将MTT溶于0.01 mol/L、pH 7.2的PBS中，使其终浓度为5 mg/ml，过滤除菌，4 ℃避光保存，保存时间不超过2周）10 μl，在温度37 ℃及5 % CO2饱和湿度的培养箱中培养4 h后，水平离心（2 000 r/min）3 min后，弃去各孔内液体，于每孔中加入100 μl二甲基亚砜，置于震荡器上震荡5 min，直至细胞内及周围的紫色颗粒充分溶解，在Elx800自动酶标仪上测定各孔540 nm处的吸光度值（optical density, OD），取3孔的平均值细胞抑制率：抑制率(%) = (1－实验组OD值/对照组OD值)×100%。
1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 （1）各组照射结束培养24 h后K562细胞的凋亡百分率：各组照射结束后培养24 h，收集5.0×105个细胞，PBS液清洗2次，弃去上清液，加入100 μl碘化丙啶（propidine iodide, PI）染液，避光反应30 min，加入PBS液 400 μl，用流式细胞仪进行检测，Multicycle软件分析计算相应的细胞凋亡百分率。（2）采用早期凋亡试剂盒AnnexinⅤFITC和PI双染法测定单纯补骨脂素对白血病细胞的作用：单纯补骨脂素终浓度为40 μg /ml和80 μg /ml，分别作用于K562细胞24 h及48 h后，收集5.0×105个细胞，用PBS液清洗2次，弃去上清液，加入含钙的PBS液 100 μl，混匀后静置10 min，加入AnnexinⅤFITC 5 μl及PI 10 μl，避光15 min后，再加入400 μl含钙的PBS液，用流式细胞仪进行检测，Multicycle软件分析计算相应的细胞凋亡百分率。
1.2.5 透射电镜下观察细胞超微结构 经PUVA处理后，收集5.0×105/ml的细胞液10 ml，PBS液清洗2次，置入2 ml离心管中离心（2 000 r/min）3 min，弃去上清液，缓缓加入2.5%戊二醛2 ml，4 ℃冰箱内静置2 h以上。然后用磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，水洗、脱水、浸透、包埋后，制作超薄切片，用透射电镜观察。
1.3 统计学方法 实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验，计量资料均数以x±s表示，所有实验数据经SPSS 10.0软件处理，进行多因素方差分析的组间差异比较。
2 结果
2.1 PUVA后48 h K562细胞的抑制率 PUVA 0 min组（即单纯补骨脂素组）对K562细胞有杀伤作用，随着其浓度的增加，抑制率亦呈上升趋势，不同浓度间抑制率的比较具有统计学意义(P<0.05)。单纯长波紫外线照射（即补骨脂素浓度为0 μg /ml）对K562细胞也有杀伤作用，照射时间0～10 min，抑制率随时间延长而上升，不同时间组比较具有统计学意义(P<0.05)。PUVA 10 min组和15 min组间比较无统计学意义。PUVA比单纯补骨脂素或单纯紫外线照射对K562细胞的杀伤作用增强，且抑制率随照射时间及补骨脂素浓度的增加而上升，比较有统计学差异(P<0.05)。见表1。
2.2 流式细胞仪检测PUVA后K562细胞的凋亡 PUVA 0、5、10和15 min组照射结束后继续培养24 h，用流式细胞仪测定亚二倍体凋亡峰，其细胞凋亡率随照射时间及补骨脂素浓度的增加而上升，各浓度之间及各照射时间之间的细胞凋亡率比较有统计学差异(P<0.05)。见表2。
表1 PUVA后48 h K562细胞的抑制率（略）
Tab 1 Inhibition rates of K562 cells 48 h after PUVA
*P<0.05, vs 0 min group; △P<0.05, vs 5 min group
表2 PUVA后24 h K562细胞的凋亡率（略）
Tab 2 Apoptotic rates of K562 cells 24 h after PUVA
*P<0.05, vs 0 min group; △P<0.05, vs 5 min group, ▲P<0.05, vs 10 min group
2.3 单纯补骨脂素对K562细胞的作用 单纯补骨脂素终浓度40 μg /ml和80 μg /ml时分别作用于K562细胞24 h，细胞凋亡率分别为2.93%和5.49%，细胞凋亡不明显；单纯补骨脂素终浓度40 μg /ml和80 μg /ml时分别作用于K562细胞48 h，细胞凋亡率分别为30.74%和34.56%，凋亡明显增加，且凋亡率随补骨脂素浓度的升高而增加。
2.4 透射电镜下细胞的形态特点 细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核染色质聚集或边集，部分细胞染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状，核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂，整个细胞可裂解成大小不一的凋亡小体。
3 讨论
PUVA光化学疗法的作用原理主要有直接光敏反应、间接光敏反应以及补骨脂素受体的参与等［3］。PUVA疗法具有选择性杀伤白血病细胞的作用，其理论依据为：（1）肿瘤细胞由于调节与生长控制系统发生障碍而致异常增生，处于分裂期的细胞较多，因此需要合成大量的核酸以满足其迅速生长的需求，所以DNA的含量常常增高，倍体的分布异常使补骨脂素与其DNA的光加合作用较正常细胞更为敏感。（2）正常情况下，超氧化物歧化酶广泛存在于需氧代谢细胞的线粒体内，具有分解超氧化物从而保护细胞的作用。肿瘤细胞内常缺少这种酶，因此在有氧条件下，经长波紫外线照射，补骨脂素呈激发态，把一个活泼的转移给氧分子而产生超氧化物，当受到超氧化物作用时，肿瘤细胞较正常细胞更为敏感，表现为膜结构、DNA、酶及蛋白质多方面的受损［4］。目前，国内外学者大多是在人工合成8甲氧基补骨脂素的基础上展开研究工作，在临床应用的过程中发现了一些毒、副反应，如光毒作用、恶心、胃部疼痛和角膜炎等。
本实验研究了中药补骨脂提纯物补骨脂素加长波紫外线照射对K562细胞的杀伤作用及其作用机制，探讨了其在临床方面的应用价值。结果显示：中药补骨脂素对K562细胞有杀伤作用，补骨脂素加长波紫外线照射比单纯补骨脂素对K562细胞的杀伤作用更强，且对细胞的抑制率随照射时间及补骨脂素浓度的增加而增大，比较有统计学差异；而长波紫外线照射10 min和15 min对细胞的抑制率比较则无统计学差异，因此认为，照射时间以10 min为最佳。实验还发现：当补骨脂素终浓度为40 μg/ml时，补骨脂素可充分溶解；浓度为80 μg/ml时，则溶解缓慢，且溶解不充分。本实验也探讨了PUVA的作用机制，用流式细胞仪检测到的亚二倍体凋亡峰以及透射电镜下观察到的典型的细胞凋亡形态，证实了其对白血病K562细胞的杀伤作用是通过诱导细胞凋亡来实现的。
由于补骨脂素具有逆转多药耐药的作用［5］，且能改善粒系造血的功能，增强机体抗感染的能力［6］，因此将其与长波紫外线联合起来用于血液病，以及作为体外净化的手段将会具有相当大的优势，值得作进一步的探讨。
［］
1 Lebwohl M, Drake L, Menter A, et al. Consensus conference: acitretin in combination with UVB or PUVA in the treatment of psoriasis［J］. Am Acad Dermatol, 2001, 45(4):544553.
2 Yoo EK, Rook AH, Elenitsas R, et al. Apoptosis induction of ultraviolet light A and photochemotherapy in cutaneous Tcell lymphoma: relevance to mechanism of therapeutic action［J］. J Invest Dermatol, 1996, 107(2): 235242.
3 崔小庆, 杨易灿. 补骨脂素加长波紫外线抗肿瘤的实验研究和应用［J］. 国外医学・肿瘤学分册, 1991, 18(3):157160.
4 闫晓光, 周训银, 吴军正. 补骨脂素类抗肿瘤作用的光敏特性研究［J］. 国外医学・肿瘤学分册, 1999, 26(2): 8386.
5 蔡 宇, 曹克俭, 殷忠东, 等. 补骨脂素胶囊对急性白血病多药耐药逆转作用的临床观察［J］. 中医药科技, 2002, 9(1): 53.
6 李振波, 丘和明, 刘国普, 等. 清毒饮和养正片对环磷酰胺所致的造血抑制小鼠粒系造血的影响［J］. 广州中医药大学学报, 1999, 16(1): 3437.
