丹参对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制研究
【关键词】 链脲霉素糖尿病
［摘要］ 目的：探讨丹参对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及其机制。方法：采用单侧肾切除、腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病肾病大鼠模型，予以丹参药物干预。观察大鼠肾脏形态学及肾功能的变化。采用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应法检测转化生长因子β1（transforming growth factorbeta1, TGFβ1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）、纤溶酶原激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor1，PAI1）等细胞因子在糖尿病大鼠肾皮质中的表达水平。结果：与正常对照组比较，用药第8周末糖尿病肾病模型组大鼠的肾脏肥大指数、平均肾小球体积、尿白蛋白排泄率、肌酐清除率均有明显升高（P＜0.05)，肾皮质TGFβ1、CTGF、PAI1和纤维连接蛋白的表达水平也有显著增高（P＜0.05)。丹参组大鼠的上述指标与糖尿病肾病模型组比较，则有明显的降低（P＜0.05)。结论：丹参可通过抑制TGFβ1、CTGF、PAI1等细胞因子的表达，从而对糖尿病大鼠肾脏起保护作用。
［关键词］ 链脲霉素糖尿病; 丹参; 转化生长因子β1; 结缔组织生长因子; 纤溶酶激活物抑制物1
Protective effects of Salvia miltiorrhiza on rats with streptozotocin diabetes and its mechanism
LIU Gang, GUAN GuangJu,QI TongGang, FU YuQin, LI XueGang, SUN Yun, WU Tao, WEN RongZhu
(Department of Nephrology, Second Hospital, Shandong University, Jinan, Shandong Province 250033, China; Laboratory of Molecular Biology, Second Hospital, Shandong University, Jinan, Shandong Province 250033, China)
ABSTRACT Objective: To explore the effects of Salvia miltiorrhiza on renal morphology and renal function of rats with streptozotocin diabetes. Methods: Thirty male Wistar rats were randomly divided into three groups, which were normal control group, untreated group and Salvia miltiorrhizatreated group. Diabetic nephropathy was induced in rats of the last two groups by intraperitoneal injection of streptozotocin after unilateral nephrectomy. Then the rats in the normal control and untreated groups were fed with normal saline while those in the Salvia miltiorrhizatreated group were fed Salvia miltiorrhiza preparation for 8 weeks. The glomerular volume (VG), kidneytobody weight ratio (KW/BW), urinary albumin excretion rate (UAER) and creatinine clearance (Ccr) were observed. The expression levels of transforming growth factorbeta1 (TGFβ1), connective tissue growth factor (CTGF), fibronectin (FN) and plasminogen activator inhibitor1 (PAI1) were detected by realtime quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) at the end of the experiment. Results: UAER, Ccr, VG and KW/BW ratio were significantly higher in the untreated group than those in the normal control group (P＜0.05). The expression levels of TGFβ1, CTGF, PAI1 and FN in the untreated group were also significantly higher as compared with those in the normal control group (P＜0.05). UAER, Ccr, VG, KW/BW ratio and the levels of TGFβ1, CTGF, PAI1 and FN in the Salvia miltiorrhizatreated group were obviously lower than those in the untreated group (P＜0.05). Conclusion: Salvia miltiorrhiza can protect rats with streptozotocin diabetes from diabetic nephropathy by suppressing the overexpressions of TGFβ1, CTGF, PAI1 and FN in renal cortex.
KEY WORDS streptozotocin diabetes; Salvia miltiorrhiza; transforming growth factorbeta1; connective tissue growth factor; plasminogen activator inhibitor1
糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）是糖尿病（diabetes mellitus, DM）常见的并发症。在西方国家，DN已成为导致终末期肾病的首要原因［1］。丹参（Salvia miltiorrhiza）对糖尿病肾病具有较好的治疗作用，但其作用机制尚不清楚。本研究通过观察转化生长因子β1（transforming growth factor beta1, TGFβ1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）及纤溶酶激活物抑制物1（plasminogen activator inhibitor 1, PAI1）等细胞因子在DN大鼠肾脏中的表达及其与肾脏结构和功能改变之间的关系，探讨丹参对肾脏保护作用的机制。
1 材料和方法
1.1 动物分组及模型建立 30只清洁级雄性Wistar大鼠，体质量180～200 g，由山东大学实验动物中心提供，随机分为正常对照组、DN模型组和丹参治疗组，每组10只。所有大鼠均经背部切口行右肾切除术。2周后，DN模型组和丹参治疗组大鼠按60 mg/kg剂量1次性腹腔内注射链脲佐菌素（美国Sigma公司产品，使用前用0.1 mol/L pH 4.5的枸橼酸缓冲液配制成1％浓度），制作DN大鼠模型。72 h后，尾静脉采血，以血糖＞16.7 mmol/L且尿糖呈强阳性作为DN大鼠模型建立标准。正常对照组仅腹腔注射等量缓冲液。
1.2 实验方法 丹参治疗组大鼠成功建立DN模型后，用丹参注射液（三九医药股份有限公司产品）按15 g・kg1・d1予以灌胃；正常对照组和DN模型组仅给予等量生理盐水灌胃。1 d/次，连续8周。用药期间，每4周测1次体重及血糖。用药第8周末，用金属代谢笼收集大鼠24 h尿，2 000 r/min离心10 min，去除沉渣，－20℃保存，备尿肌酐及尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate, UAER）检测。然后，用戊巴比妥钠按30 mg/kg行大鼠腹腔麻醉，取腹部正中切口，腹主动脉取血，2 000 r/min离心10 min，取上清，－20℃保存，备血肌酐检测。取出肾脏，剥离被膜称重后，经肾门纵向剖开，用10%中性福尔马林固定一半以上的肾组织，用石蜡包埋、切片后，行常规苏木精伊红（hematoxylin and eosin，HE）及过碘酸Schiff（periodic acidSchiff，PAS）染色；另一半以液氮保存，备逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptasepolymerase chain reaction, RTPCR）检测。
1.3 检测指标
1.3.1 生化指标 血、尿肌酐采用Hitachi7150型自动生化分析仪进行检测，尿白蛋白采用放射免疫法（放射免疫试剂盒购自原子能研究所）进行检测。内生肌酐清除率（creatinine clearance, Ccr）公式：Ccr＝［尿肌酐浓度（mg/ml）×1 min尿量（ml）］/血肌酐浓度（mg/ml），并按体质量予以校正。
1.3.2 荧光实时定量RTPCR检测 采用TRIzol Reagent（上海生工生物工程技术服务有限公司产品）提取肾皮质总RNA。电泳鉴定RNA完整性。取总RNA 2 μg逆转录合成cDNA。逆转录反应体系：随机引物2 μl，5×反应缓冲液4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，核糖核酸酶抑制剂1 μl，Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶 1 μl ，总体积20 μl。采用ABI PRISM 7000 SDS进行实时PCR检测。TGFβ1、CTGF、PAI1、纤维连接蛋白（fibronectin, FN）与3磷酸甘油醛脱氢酶（glyseraldehyde3phosphate dehydrogenase, GAPDH）引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表1。
表1 PCR引物（略）
Tab 1 Primers for quantitative realtime PCR
PCR反应体系：5×SYBR Green PCR缓冲液2 μl，dNTP 0.5 μl，MgCl2 8 μl，AmpliTaq Glod 0.25 μl，目的基因上、下游引物各2 μl，逆转录产物2 μl，总体积25 μl。PCR参数：预变性94 ℃×2 min；94 ℃×15 s、55 ℃×30 s、72 ℃×45 s，共50个循环。结果用目的基因与内参GAPDH的比值表示。
1.3.3 肾组织病检查 每张PAS染色切片在光镜下（×200）随机选取30个肾小球，用HPIAS1000彩色图像分析系统测定肾小球截面积。肾小球体积＝1.25×肾小球截面积3/2。
1.4 统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，组间比较采用方差分析和q检验。
2 结果
2.1 一般情况的比较 实验期间，DN模型组和丹参组各有1只大鼠因血糖过高、感染等原因而死亡，未纳入最后统计。DN模型组和丹参治疗组大鼠较正常对照组体质量减轻、血糖升高，差异有统计学意义（P＜0.05)。表明DN大鼠模型复制成功。DN模型组和丹参治疗组大鼠体质量、血糖比较无统计学差异，表明丹参对DN大鼠的体质量、血糖没有影响。见表2。
2.2 肾脏形态学与肾功能变化的比较 与正常对照组比较，DN模型组大鼠肾脏肥大指数（kidneytobody weight ratio, KW/BW）、平均肾小球体积（glomerular volume, VG）、UAER、Ccr均有明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），为早期DN的特征表现。丹参治疗组大鼠KW/BW、VG、UAER、Ccr较DN模型组均有明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。
2.3 肾皮质细胞因子表达的比较 荧光实时定量RTPCR检测结果显示，DN模型组大鼠肾皮质TGFβ1、CTGF、PAI1和FN基因的表达水平较正常对照组大鼠均有明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。丹参治疗组大鼠上述指标与DN模型组比较，则有明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4 。
表2 3组大鼠体质量、血糖变化的比较（略）
Tab 2 Changes of body weight and blood glucose level of rats in 3 groups
*P＜0.05, vs normal control group
表3 3组大鼠肾脏形态学及肾功能变化的比较（略）
Tab 3 Renal morphology and renal function of rats in 3 groups
*P＜0.05, vs normal control group; △P＜0.05, vs untreated group
表4 3组大鼠肾皮质TGFβ1、CTGF、PAI1、FN表达的比较（略）
Tab 4 Expression levels of TGFβ1, CTGF, PAI1 and FN in kidney cortex of rats in 3 groups
*P＜0.05, vs normal control group; △P＜0.05, vs untreated group
3 讨论
细胞外基质（extracellular matrix, ECM）沉积是DN特征性的病理改变。合成与降解失衡是造成ECM积聚的主要原因［2］。许多细胞因子参与了这一病理过程，并在DN的发生过程中起着非常重要的作用［3］。其中TGFβ在ECM的积聚中起关键作用。CTGF被认为是介导TGFβ促纤维化活性的下游效应因子，在刺激细胞增生、ECM合成及促进组织器官纤维化方面起着重要作用［4］。TGFβ1刺激成纤维细胞产生胶原Ⅰ及FN的效应是由CTGF介导的［5］。Ito等［6］采用原位杂交方法，发现在新月体肾炎、IgA肾病、局灶节段性肾小球硬化及DM患者的肾小球新月体、系膜增生部位及肾间质纤维化区域，均出现CTGF mRNA的高表达。Riser等［7］研究发现，db/db DN模型小鼠在DN早期，其肾小球系膜区的CTGF mRNA的表达较正常对照组增高28倍，说明CTGF与肾小球ECM的蓄积相关。纤溶酶/基质金属蛋白酶系统在调节ECM的降解过程中具有十分重要的作用。体内纤溶酶原激活物包括组织型和尿激酶型两种，其活性均受到纤溶酶原灭活剂的抑制，其中尤以PAI1最为重要。肾小球系膜细胞及上皮细胞均可产生PAI1。PAI1不仅能维持凝血与纤溶平衡，还参与ECM的降解过程，可直接降解FN、层黏连蛋白及明胶，但不降解胶原；可激活基质金属蛋白酶系统，进而降解包括胶原在内的几乎所有的ECM成分［8］。
丹参属活血化瘀类中药，具有降低血黏度、抗凝、抗血栓、促进纤溶、改善微循环等作用。丹参具有明显降低急慢性肝损伤动物血清转氨酶活力、促进肝细胞再生、抑制胶原纤维增生、防止实验性肝硬变发生的作用，还可以促进已形成的胶原纤维降解和肝纤维的重吸收［9］。丹参对肾间质纤维化影响的研究报道较少。彭佑铭等［10］发现，丹参注射液可降低阿霉素大鼠肾皮质Ⅳ型胶原和层黏连蛋白的含量，减轻阿霉素所致肾小球硬化的程度。丹参的水溶性成分之一丹酚酸A可抑制小鼠成纤维细胞的增殖，降低成纤维细胞内胶原的合成率，是丹参抗纤维化的有效成分之一［11］。通过结扎单侧输尿管建立肾间质纤维化动物模型的研究显示，丹参注射液可降低梗阻侧大鼠肾脏TGFβ1 mRNA和蛋白的水平、下调α平滑肌肌动蛋白的表达、减轻相对间质容积的增加、减少Ⅰ型胶原的沉积，从而延缓肾间质纤维化的产生［12］。
本实验结果表明：DN大鼠肾脏中TGFβ1、CTGF、PAI1等细胞因子的表达明显增高，同时伴有肾脏结构与功能的改变，说明在DN早期，这些细胞因子生成增多，一方面促使肾小球体积增大、滤过面积增加，从而导致DN时肾小球高滤过的发生；另一方面，可造成ECM的大量沉积，致使肾小球滤过屏障受损而出现蛋白尿。丹参治疗组大鼠TGFβ1、CTGF、PAI1等细胞因子表达较DN模型组则有明显下降，说明丹参可显著降低DN大鼠肾脏TGFβ1、CTGF、PAI1等细胞因子的表达水平、减少ECM的沉积、缩小肾小球体积、减少尿白蛋白的排泄，从而起到较好的保护肾脏的作用。
［］
1 Molitch ME, DeFronzo RA, Franz MJ, et al. Nephropathy in diabetes［J］. Diabetes Care, 2004, 27(Suppl 1):S79S83.
2 Eikmans M, Baelde JJ, de Heer E, et al. ECM homeostasis in renal diseases: a genomic approach［J］. J Pathol, 2003, 200(4): 526536.
3 Wolf G. Growth factors and the development of diabetic nephropathy［J］. Curr Diab Rep, 2003, 3(6): 485490.
4 柳 刚, 关广聚. 结缔组织生长因子与糖尿病肾病［J］. 中西医结合肾病杂志, 2004, 5(5): 305307.
5 Duncan MR, Frazier KS, Abramson S, et al. Connective tissue growth factor mediates transforming growth factor betainduced collagen synthesis: downregulation by cAMP［J］. FASEB J, 1999, 13(13): 17741786.
6 Ito Y, Bende RJ, Oemar BS, et al. Expression of connective tissue growth factor in human renal fibrosis［J］. Kidney Int, 1998, 53(4): 853861.
7 Riser BL, Cortes P. Connective tissue growth factor and its regulation: a new element in diabetic glomerulosclerosis［J］. Ren Fail, 2001, 23(34): 459470.
8 Rerolle JP, Hertig A, Nguyen G, et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 is a potential target in renal fibrogenesis［J］. Kidney Int, 2000, 58(5): 18411850.
9 孙玉凤, 姚希贤, 蒋树林. 肝纤维化的中医中药研究［J］. 世界华人消化杂志, 2000, 8(6): 686687.
10 彭佑铭, 刘伏友, 罗季安, 等. 丹参及生脉液对阿霉素所致大鼠肾小球硬化的实验性治疗作用［J］. 湖南医科大学学报, 1999, 24(4): 332334.
11 王晓玲, 刘 平, 刘成海, 等. 丹酚酸A对成纤维细胞活力、增殖及胶原合成的影响［J］. 中西医结合肝病杂志, 2000, 10(1): 2425.
12 林琼真, 于 洁, 邓英辉, 等. 丹参注射液对大鼠梗阻性肾间质纤维化的保护作用［J］. 中国中西医结合肾病杂志, 2003, 4(2): 7173.
