蟾毒灵对裸鼠人肝癌移植瘤的抑制作用 及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响
作者：顾伟，韩克起，苏永华，黄雪强，凌昌全
【摘要】 探讨蟾毒灵对裸鼠人肝癌原位移植模型的抗肿瘤作用及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法:建立裸鼠人肝癌原位移植模型，随机分为蟾毒灵高（1.5 mg/kg）、中（1 mg/kg）、低（0.5 mg/kg）剂量组，阿霉素8 mg/kg治疗组和模型组。裸鼠人肝癌原位移植模型第25天测量肿瘤体积，取瘤组织做HE染色观察肿瘤坏死程度并行电镜观察，DNA原位末端标记法检测凋亡标记指数，免疫组化法检测肝癌组织中Bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:蟾毒灵各剂量组肿瘤体积均较模型组明显缩小（ P <0.01），生存期较阿霉素治疗组及模型组延长 （ P < 0.05）。电镜观察到蟾毒灵各组肿瘤出现明显的细胞凋亡征象，低、中、高剂量治疗组的凋亡指数分别为5.87±2.13、8.86±2.96和10.60±3.42，明显高于阿霉素治疗组的3.28±0.98（ P <0.05或 P < 0.01）; 蟾毒灵各组瘤组织的Bax表达明显增强，而Bcl-2表达无明显改变。结论:蟾毒灵对裸鼠人肝癌原位移植模型有明显的抗肿瘤作用，其作用机制可能与上调Bax表达、诱导细胞凋亡有关。
【关键词】 蟾毒灵; 肝癌; 细胞凋亡; Bcl-2; Bax; 裸小鼠
蟾毒灵（bufalin）是从中药蟾酥中提取的一种毒性配基之一，分子式为C24H32O4，相对分子质量为386.5。研究表明，蟾毒灵具有诱导肿瘤细胞分化和凋亡的作用，主要涉及到白血病、前列腺癌、胃癌、肝癌等人类肿瘤，且仅限于体外研究［1～4］。本文旨在探讨蟾毒灵对人肝癌裸鼠原位移植模型的体内抗肿瘤效应及对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物和瘤株 BALB/C-nu/nu裸鼠，由复旦大学实验动物中心提供，SCKK（沪）2003-0003，4～5周龄，体质量18～20 g，雄性，在无特殊病原菌条件下分笼饲养。人肝癌细胞株BEL-7402，由院上海细胞生物学研究所提供，由第二军医大学长海中医科实验室传代冻存。
1.1.2 药物和试剂 蟾毒灵，美国Sigma公司产品;阿霉素（adriamycin， ADM），深圳万乐药业有限公司产品;DNA原位末端标记试剂盒，Boehringer Mannhein公司产品;鼠抗人Bcl-2和Bax蛋白单克隆抗体，Santa Cruz公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 模型分组及处理 参照制作裸鼠人肝癌原位移植模型［5，6］，随机分为蟾毒灵1.5、1.0和0.5 mg/kg治疗组，ADM治疗组和模型组，每组 15只。 各组均于造模后第15天用药，蟾毒灵治疗组分别腹腔注射，第15～24天，1次/d;模型组注射等体积的生理盐水（normal saline， NS），方法同蟾毒灵组;ADM按8 mg/kg腹腔注射，仅在造模第 15天 给药1次。停药次日每组处死荷瘤鼠10只，用游标卡尺分别测量瘤体的长径（a）和短径（b），依据公式V=ab2/2肿瘤体积;抑瘤率（%）=［1-（V治疗组/V模型组）］×100。每组剩余小鼠（5只）观察生存期，计算生命延长率。生命延长率（%）=［（药物组平均存活天数-NS组平均存活天数）/NS组平均存活天数］×100。
1.2.2 组织学及电镜观察 部分瘤组织用10%福尔马林固定，石蜡切片，HE染色作常规病理检查，观察肿瘤组织坏死程度［7］。剩余瘤组织以3%戊二 醛固定1～3 h，缓冲液冲洗后，用1%四氧化锇固定1～2 h，梯度丙酮脱水和Epon 812包埋，醋酸双氧铀与柠檬铅双染色、切片，染色，透射电镜下观察拍照。
1.2.3 DNA原位末端标记检测 采用TdT介导的带生物素dUTP缺口末端标记技术（terminal de-oxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling， TUNEL）检测细胞凋亡指数［7］。以PBS代替TUNEL反应液作为阴性对照，以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞。每张切片观察10个高倍视野，阳性记数采用双盲法，计数时避开肿瘤坏死区，每100个细胞中的阳性细胞数为标记指数（label index， LI）。
1.2.4 Bcl-2和Bax蛋白的免疫组化检测 采用过氧化酶标记的链霉卵白素（streptavidin peroxidase， SP）法，DBA显色，按照试剂说明书的流程进行检测。在光镜下观察，以胞浆内棕黄色细颗粒为Bcl-2和Bax阳性染色，细胞计数方法同TUNEL检测。
1.3 统计学方法 以SPSS 11.0软件进行统计学分析，数据用 x ±s 表示，进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 荷瘤裸鼠体质量及肿瘤变化 治疗前各组肿瘤大小差异无统计学意义（ P >0.05），提示各组瘤体大小具有可比性。与模型组相比，裸鼠人肝癌原位移植模型经蟾毒灵和ADM治疗后瘤体均明显缩小（ P <0.01），蟾毒灵高剂量治疗组的抑瘤率高于ADM治疗组，差异有统计学意义（ P <0.05）;蟾毒灵治疗前后各组裸鼠的体质量无明显改变（ P > 0.05）。 见表1。
2.2 平均生存期及生命延长率 蟾毒灵治疗后各组裸鼠的平均生存期均有所延长，蟾毒灵高、中、低剂量治疗组生命延长率分别为35.9%、29.9%和17.1%，蟾毒灵各组与模型组生存时间相比，差异均有统计学意义（ P <0.05），以蟾毒灵高剂量治疗组最为明显，而ADM治疗组裸鼠生存期未见延长。见图1。
2.3 肝肿瘤坏死程度 治疗后，模型组瘤组织呈轻度坏死，蟾毒灵高、中剂量治疗组和ADM治疗组癌灶内有大量纤维结缔组织增生，肝癌组织以中重度坏死为主。但坏死灶主要集中在肿瘤中央部位，肝癌细胞在癌灶边缘生长仍较为活跃。见图2。
2.4 肝癌细胞的超微结构 模型组癌细胞表面不规则，核大呈圆形，染色质增多，游离核糖体较多，胞质内可见较丰富的线粒体及内质网。蟾毒灵各治疗组常可见细胞核固缩的肝癌细胞，胞浆浓缩，染色质浓集于核膜内侧呈团块或新月状，胞浆起泡和凋亡小体，并见凋亡小体脱离细胞体，没入间质或被其他 细胞吞饮。
2.5 瘤组织凋亡标记指数及Bcl-2和Bax蛋白的表达 蟾毒灵治疗组肝癌细胞的凋亡指数分别明显高于模型组，ADM治疗组凋亡指数未见明显增加。蟾毒灵治疗组Bcl-2蛋白阳性表达率均有所降低，表达强度较弱，但与模型组比较，差异无统计学意义;瘤组织均见Bax蛋白高表达，Bax蛋白表达标记指数随着蟾毒灵剂量的增加而提高。见表2、图3。
表1 裸鼠人肝癌原位移植模型蟾毒灵治疗前后体质量及瘤体变化（略）
Table 1 Changes of mouse body weight and tumor volume of human hepatocellular orthotopically transplanted tumor induced by bufalin
*P <0.05， vs ADM-treated group;△△P <0.01， vs NS-treated group.
图1 各组平均生存时间（略）
Figure 1 Mean survival time of five groupsBu1: High-dose bufalin-treated group; Bu2: Medium-dose bufalin-treated group; Bu3: Low-dose bufalin-treated group;*P <0.05， vs NS-treated group; n =5.
图2 瘤组织坏死程度的病理形态（HE染色， ×250）（略）
Figure 2 Pathological characteristics of tumor necrosis （HE staining， ×250）A: NS-treated group; B: High-dose bufalin-treated group.
表2 肝癌组织细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的标记指数（略）
Table 2 Label index of tumor cell apoptosis and expressions of Bcl-2 and Bax in tumor tissues
*P <0.05，**P <0.01， vs NS-treated group.
图3 裸鼠原位肝内移植瘤Bax蛋白的表达（SP法， ×200）（略）
Figure 3 Expression of Bax in orthotopically transplanted tumor of human hepatocellular carcinoma in nude mice （SP method， ×200）
A: Bax expressed weakly in NS-treated group. B: High expression in high-dose bufalin-treated group.
3 讨论
蟾酥及其相关制剂一直是临床肝癌最有效的中药之一［8］。蟾酥的化学成分复杂，通过对蟾酥的分离和鉴定，主要的化学成分已得到部分确认［9，10］。蟾毒灵是从中药蟾酥中提取的毒性配基之一，属于细胞拓扑异构酶Ⅱ抑制剂。蟾毒灵对血液肿瘤、前列腺癌、胃癌等人类肿瘤的抑制作用已有报道，但未见有对人肝癌细胞的体内研究报道。在对蟾毒灵抗肿瘤的前期研究中发现蟾毒灵在体外对人肝癌SMMC-7721和BEL-7402细胞株具有较强的杀伤作用，诱导肝癌细胞凋亡及细胞周期G2/M期阻滞，这可能是蟾毒灵抗肝癌的作用机制［4，11］，但蟾毒灵在体内抗人肝癌的作用仍不清楚。蟾毒灵对小鼠的LD50为2.2 mg/kg［12］，本实验预实验也发现2 mg/kg的一次性给药剂量就可使小鼠发生一过性的痉挛性抽搐，但未引起小鼠中毒性死亡。鉴于此，本实验主要研究给予1.5 mg/kg及以下剂量蟾毒灵时动物体内的抗肿瘤作用。人类肿瘤裸鼠原位移植瘤模型是抗癌药物筛选和机制研究较为理想的动物模型，我们成功建立了裸鼠人肝癌原位移植模型，在此基础上观察蟾毒灵对裸鼠原位人肝癌移植模型的抗肿瘤效果，结果表明蟾毒灵按总量15、10和5 mg/kg分10 d连续给药治疗裸鼠原位人肝癌移植性模型在瘤体缩小方面具有与阿霉素8 mg/kg相同的疗效，且在带瘤生存期的延长及模型生活质量（体质量的增减）的改善方面，蟾毒灵各治疗组明显优越于阿霉素治疗组。提示蟾毒灵在体内具有良好的抗肝癌作用。病及TUNEL检测结果发现，高、中剂量蟾毒灵不仅能导致肝癌组织中、重度坏死及大量纤维结缔组织增生，而且能原位诱导肝癌细胞凋亡，凋亡标记指数与蟾毒灵给药呈剂量依赖性。细胞凋亡是由于细胞内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起的细胞主动死亡的过程。Bcl-2基因家族是细胞凋亡研究中最受重视的基因，目前已发现几个与Bcl-2同源的基因，包括Bcl-xL、Bcl-xs、Bax、Bak、mcl-1、A1、Bag-1、Bfl-1、ced9、BHRF-1等，构成了Bcl-2家族。其中Bax基因是Bcl-2家族中的一员，其生物学作用是拮抗Bcl-2，与Bcl-2形成二聚体，抑制或促进细胞凋亡。Bcl-2和Bax的比例决定细胞的凋亡状态:Bcl-2表达水平高于Bax时，Bcl-2和Bcl-2形成同源二聚体，细胞凋亡受抑制;Bax表达水平高于Bcl-2时，则形成Bax-Bax同源二聚体，细胞凋亡增强［13］。有资料显示，Bcl-2蛋白在肝癌组织和肝癌细胞系中，一般只呈低水平的表达 或不表达，而Bax蛋白则呈较高水平的表达［14］。本研究中裸鼠人肝癌原位移植瘤的免疫组化结果显示，Bcl-2蛋白阳性表达率仅为9.05%，而Bax蛋白阳性表达率为31.25%，这与报道一致。蟾毒灵治疗后均未见瘤组织Bcl-2表达率的明显变化，而Bax表达却明显提高，瘤组织Bax蛋白阳性标记指数与凋亡标记指数有正相关趋势（ r =0.876 8），提示上调Bax蛋白表达、诱导肝癌细胞凋亡可能是蟾毒灵体内抗肝癌的机制之一。
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