益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠转化生长因子β1的影响
作者：张臻, 阙华发, 朱元颖, 王云飞, 刘晓鸫, 郑培永
【关键词】 糖尿病; 皮肤溃疡; 转化生长因子β1; 大鼠
糖尿病溃疡是糖尿病的常见并发症之一。益气化瘀中药糖尿病溃疡取得了良好疗效［1］，为进一步探讨其促进糖尿病溃疡创面愈合的机制，开展了本研究。
1 材料与方法
1.1 实验动物 清洁级2月龄SD大鼠60只，雄性，体质量200～250 g，平均（223.05±14.91）g，由院上海实验动物中心提供。动物合格证号：医动字第02?22?2号。
1.2 药物 益气化瘀方由生黄芪、太子参、桃仁和地龙组成，剂量比例为2.5∶2.5∶1∶1，大鼠的剂量为11.61 g/(kg·d)，减压浓缩至浓度为含生药2.5 g/ml。拆方益气方由生黄芪和太子参组成，大鼠的剂量为6.75 g/(kg·d)，减压浓缩至浓度为含生药1.5 g/ml。拆方化瘀方由桃仁和地龙组成，大鼠的剂量为4.86 g/(kg·d)，减压浓缩至浓度为含生药1 g/ml［2］。均由上海中医药大学龙华制剂室按水煎醇沉工艺制备成煎剂浓缩，4 ℃冰箱保存备用。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）贝复济，珠海东大生物制药有限公司产品（批准号：国药准字S10980077）。
1.3 主要实验试剂 转化生长因子β1（transforming growth factor?β1, TGF?β1）一抗，Santa Cruz公司产品（Sc?146），工作浓度1∶80；HRP标记山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司产品（ZB?2301）；化学发光底物，Pierce公司产品；NC膜（0.45 μm），Millipore公司产品。
1.4 主要实验仪器 RM2145切片机，Leica公司产品；IMS细胞图像分析仪，上海申腾信息技术有限公司产品；MV?CP410摄像机，Panasonic公司产品；BH2显微镜，Olympus公司产品；DYY?8C电泳仪、DYCZ?24D电泳槽和DYCZ?40D转印槽，均为北京六一仪器厂产品；721分光光度计，上海分析仪器总厂产品。
1.5 糖尿病溃疡大鼠模型建立 实验前12 h禁食，定量饮水。将1％链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）溶液，以60 mg/kg剂量腹腔内注射2 d。3 d后动物血糖浓度大于16.7 mmol/L及尿糖为（++++）时，即成糖尿病鼠模型。参照付小兵等［3］全层皮肤缺损法制成动物体表溃疡模型，将糖尿病大鼠用盐酸氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉后背部备皮，在脊椎两侧分别作直径15 mm的圆形标记，在无菌条件下，用外科方法切除标记处全层皮肤，止血后用无菌纱布覆盖，即成糖尿病溃疡模型。造模后每只大鼠每日予青霉素40万U肌肉注射，连续4 d。
1.6 实验动物分组及给药方法 60只大鼠先随机抽取10只为正常对照组；其余50只大鼠建立糖尿病溃疡模型，成模后再随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、贝复济组和模型组。各组于造模后次日开始给药，换药前均以1/5 000呋喃西林溶液清洁创面。正常对照组及模型组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃，1次/d；益气化瘀组、益气组和化瘀组外敷单层生理盐水纱布，中药灌胃，1次/d；贝复济组灌服等量生理盐水，外敷以贝复济浸透纱布（60 U/cm2），按创面大小剪成小块贴于创面上，然后均在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定。连续用药7 d，用药后第8天，分别将动物麻醉（盐酸氯胺酮），取局部创面新生肉芽组织为所需实验样品。
1.7 实验方法
1.7.1 免疫组织化学SP法及图像分析 每组随机抽取8个标本作为实验样本，取4 μm石蜡切片，常规脱蜡，PBS冲洗3次，3 min/次；3％ H2O2室温20 min，PBS冲洗3次，3 min/次；柠檬酸盐缓冲液中微波处理（98 ℃）2次，10 min/次；10%正常血清封闭内源性非特异性抗原，室温30 min，一抗4 ℃过夜，PBS冲洗3次，3 min/次；生物素化羊抗兔IgG 1∶200，37 ℃ 30 min，PBS冲洗3次，3 min/次；Streptavidin?HRP 1∶200，37 ℃ 30 min，PBS冲洗3次，3 min/次；DAB显色8～12 min，水洗；苏木素衬染，水洗，吹干，树脂封片。显微镜下观察，有棕黄染色者为阳性。采用IMS细胞图像分析系统，对各组免疫组化切片进行图像分析。根据各组切片中的染色条件，在统一阈值下进行。在10倍物镜下，每张切片随机选取3个视野，输入图像，测定各组在统一光度下阳性细胞的总面积。
1.7.2 Western blotting法 每组随机抽取6个标本作为实验样本，分别取大约200 mg组织制备样品，提取创面肉芽组织总蛋白，各样品取30 μg上样，Marker取10 μl上样（上样前按说明书进行预处理），进行SDS?聚丙烯酰胺凝胶电泳。电转移至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶粉封闭，分别与特异性的TGF?β1抗体进行孵育，充分洗涤后孵育HRP标记山羊抗小鼠抗体，电化学发光，X线摄片。用Quantity One 4.3.1（Bio?rad）软件对照片进行扫描分析，测定蛋白表达量。
1.8 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件，以方差分析比较各组间TGF?β1表达水平的差异。
2 结果
2.1 免疫组织化学法检测各组创面肉芽组织中TGF?β1的表达水平 模型组TGF?β1表达明显低于正常对照组（P＜0.01）；益气化瘀组TGF?β1表达量高于益气组、化瘀组、贝复济组和模型组（P＜0.05或P＜0.01），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；益气组和化瘀组的TGF?β1表达量也明显高于模型组（P＜0.01），与贝复济组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；益气组和化瘀组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。
2.2 Western blotting法检测各组创面肉芽组织中TGF?β1的表达水平 模型组TGF?β1表达明显低于正常对照组（P＜0.01）；益气化瘀组TGF?β1表达量明显高于益气组、化瘀组、贝复济组和模型组（P＜0.01），与正常对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；益气组和化瘀组明显高于模型组（P＜0.01），益气组和化瘀组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图2。
表1 各组创面TGF?β1的表达（略）
Table 1 TGF?β1 expression of skin ulcers in rats with diabetes
*P＜0.05, **P＜0.01, vs untreated group; △P＜0.05, △△P＜0.01, vs normal control group; ▲P＜0.05, ▲▲P＜0.01, vs Yiqi Recipe?treated group; □P＜0.05, □□P＜0.01, vs Huayu Recipe?treated group; ■P＜0.05, ■■P＜0.01, vs bFGF?treated group.
图1 术后第7天各组大鼠肉芽组织中TGF?β1的表达水平（SP, ×100）（略）
Figure 1 Expression of TGF?β1 in granulation tissue of the rats in six groups seven days after skin lesion (SP, ×100）
A: Yiqi Huayu Recipe?treated; B: Yiqi Recipe?treated; C: Huayu Recipe?treated; D: Untreated; E: bFGF?treated; F: Normal control.
Yiqi Huayu Recipe?treated; B: Yiqi Recipe?treated; C: Huayu Recipe?treated; D: Untreated; E: bFGF?treated; F: Normal control.
图2 术后第7天各组6个大鼠肉芽组织样本中TGF?β1的表达水平（Western blotting）（略）
Figure 2 Expression of TGF?β1 in granulation tissue of the rats in six samples seven days after skin lesion (Western blotting)
3 讨论
糖尿病溃疡的发生、和变化是“因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正”的过程，其病本虚标实，正气不足，气阴两虚为其本，湿热互结，气血瘀滞为其标。“虚”、“瘀”是糖尿病患者创面难以愈合的关键。唐汉钧教授在长期临床和实验研究的基础上，认为只有气血足、瘀滞祛除，才能断生腐之源，生肌长皮，故以“祛瘀生新”为指导，提出“祛瘀生肌”、“补虚生肌”理论，临床以益气化瘀法为主糖尿病取得良好的临床疗效［4］。随着近年来分子生物学等学科的发展，对糖尿病创面愈合机制的研究日趋深入。多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的作用是该过程中的关键因素之一［5］。各种生长因子参与了伤口愈合的调控，在组织修复中有决定意义。其中TGF?β的主要作用是调节细胞的生长和分化，诱导细胞外基质的合成及细胞凋亡，是一类对创面修复有重要调控作用的多功能的生长因子［6］。TGF?β主要分为三个亚型。遭受创伤后，TGF?β1、2、3的表达开始增加，其中TGF?β1的表达时程变化与微小血管形成有一致性，说明TGF?β1对血管形成有影响作用。TGF?β2、3的表达持续时间较长，可能参加愈合后期的组织塑性。而主要发挥增加胶原沉积，加速创伤愈合，同时促进瘢痕形成作用的为TGF?β1。因此，TGF?β1在溃疡创面组织中含量的变化对溃疡发生和修复愈合发挥核心作用，其表达水平的高低直接关系到创面愈合的速度和质量。国内外研究发现，皮肤伤口愈合包括连续而又相互重迭的3个阶段，即炎症期、肉芽组织形成期和瘢痕形成期［7］。伤后第7天，即创伤愈合的中期，是成纤维细胞增生和胶原合成的高峰期，TGF?β1的含量在此时也达到最高值［8, 9］。TGF?β1在早中期表达的升高，对促进成纤维细胞合成胶原蛋白、蛋白聚糖、纤维联接蛋白和整合蛋白，增强上皮细胞迁移与成纤维细胞合成细胞外基质有关键性作用，是其促进创面愈合的一个重要方面［10］。本研究发现，与正常对照组相比，模型组创面愈合率较低，愈合时间较长，并且TGF?β1表达水平也较低（P＜0.01），提示糖尿病创面难以愈合可能与TGF?β1表达水平下降有密切关系。益气化瘀组、益气组及化瘀组的创面愈合率较高，愈合时间短，与模型组相比，创面TGF?β1的表达明显增高（P＜0.01），且益气化瘀组TGF?β1的表达高于益气组及化瘀组。因此可以初步证明，在创伤愈合的早中期运用益气化瘀中药，可能通过上调TGF?β1的表达水平而促进创面愈合，且益气及化瘀中药也分别有一定程度的作用。结合TGF?β1促进成纤维细胞增生和胶原合成的主要生物学作用，也初步印证了“化瘀生肌”和“补虚生肌”的学术理论。益气化瘀组的治疗效果要优于益气组和化瘀组。《医林改错》有云：“元气既虚，必不能达于血管，血管无力，必停留而瘀。”气为血帅，络脉空虚，则无力推动血行，使气血运行稽迟，瘀血内生，或停留于局部而为瘀；瘀血不去，新血不生，正气无由恢复，则正气耗损益剧，两者互为因果。而益气法和化瘀法中药配伍使用，正气足则瘀滞除，瘀祛则新生，两者相互为用，其作用更为显著，体现了中医相须配伍的性，是临床取得疗效的关键所在，也体现了中医辨证论治的精华。
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