益气消积方含药血清对人胃癌NKN?28细胞株的作用
【关键词】 胃癌; 血清; 肿瘤; 大鼠
益气消积方（Yiqi Xiaoji Recipe, YQXJR）是根据上海大学医学院瑞金中医科主任沈小珩教授十多年致力于肿瘤研究的临床经验，并结合临床实践而出的新一代抗癌复方，临床观察对胃癌有较好的作用。本次实验采用益气消积方含药血清，温育体外培养的人胃癌NKN?28细胞，通过甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞增殖抑制作用，研究该方对体外培养的人胃癌NKN?28细胞生长的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 SD大鼠50只，雄性，清洁级动物，体质量（250±30）g，由上海交通大学医学院瑞金医院动物房提供；人胃癌高分化腺癌细胞系NKN?28细胞，由上海瑞金医院消化内科实验室负责孵育提供；益气消积方主要由黄芪、全蝎和白花蛇舌草等组成，生药购自上海瑞金医院中药房，由中药房代煎，上海中药研究所实验室浓缩而成，含生药量为2.8 g/ml；RPMI?1640培养液、胰蛋白酶为Gibco公司分装,批号31800?022；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料研究所产品；MTT，上海实生细胞生物技术有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide, DMSO），美国Fisher世界公司香港分公司产品；TE2000?U多功能倒置相差显微镜，日本Nikon公司产品；MK3酶标仪，芬兰雷勃公司产品。
1.2 益气消积方含药血清的制备
1.2.1 含药血清的制备 选用正常SD大鼠36只，禁食12 h后，予益气消积方煎液灌胃给药。大鼠分为3个剂量组（每组12只）分别给药，给药剂量分别为，低剂量组1.17 g/kg，中剂量组5.85 g/kg，高剂量组11.7 g/kg，分别相当于60 kg成日用量的同倍、5倍、10倍。给药方式为每天分2次给药，即采用一次及二次重复（2 h后相同剂量重复给药一次）给药方法。连续灌胃3 d，第3天第1次给药2 h后再给药1次，1 h后，乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置2 h以上，1 500 r/min，离心15 min，10 min后取血清，按灌胃浓度分别混合，56 ℃，30 min灭活，分装，－20 ℃冰箱保存备用［1］。
1.2.2 大鼠正常血清制备 对照组SD大鼠14只用生理盐水灌胃，每只2 ml/次，2次/d，连续3 d。于第3天第1次灌胃2 h后再灌胃1次，1 h后，乙醚麻醉，无菌条件下腹主动脉取血，静置2 h以上，1 500 r/min，离心15 min，10 min后取血清，56 ℃，30 min灭活，分装，－20 ℃冰箱保存备用。
1.3 细胞培养 NKN?28细胞株常规培养于含10％新生牛血清的RPMI?1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5％ CO2孵育箱中进行连续培养［2］。
1.4 倒置显微镜下细胞生长状态观察 上述培养细胞，去掉培养液，分别加入以上各组血清，在CO2培养箱中继续培养24 h和48 h，将培养瓶在倒置显微镜下作生长状态观察。
1.5 细胞抑制率的检测 取浓度为1×105个/ml处于对数生长期贴壁生长的人胃癌NKN?28细胞，按1×104个细胞/孔的浓度接种于96孔培养板（200 μl/孔），放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后取出，吸弃培养板上清后加入高、中、低浓度含药血清及空白血清，每种浓度设1/2、1/4、1/8、1/16四种不同比例，200 μl/孔，每种比例设6个复孔。放回培养箱中，使药物与细胞共同孵育48 h和72 h。取出培养板，向每孔加入MTT 20 μl，继续培养2 h后终止培养，小心吸去孔内上清，每孔加入DMSO 150 μl，再放回培养箱中培养30 min，使结晶物充分溶解之后，在酶联免疫检测仪570 nm处读取各孔光密度值（即OD值）。抑瘤率（％）=（1－OD实验组/OD对照组）×100［3］。
1.6 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件包进行数据分析，计量资料以x±s表示，组间比较用单因素方差分析和LSD检验。
2 结果
2.1 人胃癌NKN?28细胞生长状况 倒置显微镜下，对照组的人胃癌NKN?28细胞可见贴壁生长，细胞形态呈梭形，胞浆均匀，细胞透明，相邻细胞生长融合成片；而经含药血清处理的各组细胞，24 h可见细胞由贴壁而脱落，至48 h脱落更明显，脱落细胞悬浮于培养液中，细胞形态变圆或不规则，细胞变暗。比较含药血清各组细胞生长状况，以高剂量组含药血清组作用48 h脱落最明显。说明益气消积方有抑制人胃癌NKN?28细胞生长的作用，呈现一定的时间浓度依赖性。
2.2 MTT检测结果
2.2.1 48 h不同浓度不同比例含药血清的抑瘤作用 经单因素方差分析，四组48 h不同浓度不同比例含药血清对人胃癌NKN?28细胞的抑瘤率差异有统计学意义（P＜0.01）。经LSD组间检验，在1/2、1/4血清比例时，高、中剂量组的抑瘤率均明显高于空白血清组，差异有统计学意义（P＜0.01），低剂量组的抑瘤率略高于空白血清组，差异无统计学意义（P＞0.05）；在1/8血清比例时，高剂量组的抑瘤率高于空白血清组，差异有统计学意义（P＜0.01），中、低剂量组的抑瘤率略高于空白血清组，差异无统计学意义（P＞0.05）；在1/16血清比例时，高、中、低三个剂量组的抑瘤率略高于空白血清组，差异无统计学意义（P＞0.05）。同时1/2、1/4、1/8血清比例时，高剂量的抑瘤率明显高于各低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.05）；1/16血清比例时，高剂量的抑瘤率略高于各低剂量组，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明益气消积方有抑制人胃癌NKN?28细胞增殖的作用，其抑制作用以高剂量组最佳。见表1。
2.2.2 72 h不同浓度不同比例含药血清的抑瘤率 经单因素方差分析，四组72 h不同浓度不同比例含药血清对人胃癌NKN?28细胞的抑制率差异有统计学意义（P＜0.01）。经LSD组间检验，在各血清比例时，高剂量组的抑制率均高于空白血清组，差异有统计学意义（P＜0.01）。在1/2、1/4血清比例时，中剂量组的抑制率高于空白血清组，差异有统计学意义（P＜0.01）；在1/2血清比例时，低剂量组抑瘤率高于空白血清组，差异有统计学意义（P＜0.01）。在各血清比例时，高剂量组的抑瘤率均高于各低剂量组，差异有统计学意义（P＜0.01）。说明益气消积方有抑制人胃癌NKN?28细胞增殖的作用，且这种抑制作用随着中药浓度及时间的增加而有所提高。见表2。
表1 48 h不同浓度不同比例含药血清的抑瘤率（略）
Table 1 Inhibition rates of NKN?28 cells after 48?hour treatment of four groups of rat serum
*P＜0.05, vs normal control serum group; △P＜0.05, vs high?dose group.
表2 72 h不同浓度不同比例含药血清的抑瘤率（略）
Table 2 Inhibition rates of NKN?28 cells after 72?hour treatment of four groups of rat serum
*P＜0.05, vs normal control serum group; △P＜0.05, vs high?dose group.
3 讨论
本实验采用血清药方法观察了益气消积方含药血清抑制人胃癌NKN?28细胞增殖的作用。益气消积方以黄芪益气扶正为君药，白花蛇舌草和全蝎清热、解毒、消积为臣药。药理研究证实白花蛇舌草提取物能激活T细胞，使其释放干扰素γ，杀死肿瘤细胞，具有抗突变、抗烟焦油对淋巴细胞DNA的杀伤和增强人体非特异性免疫功能的作用；白花蛇舌草中含有微量元素如有机锗，对氧自由基有较强的清除作用［4］。马氏钳蝎蝎毒可抑制和阻断人食管癌细胞从G0/G1向S期增殖，从而抑制癌细胞增殖。其抗肿瘤作用，一是通过增强免疫功能取效，二是通过抑制癌细胞内DNA合成，直接影响肿瘤的生存和增殖［5］。本实验表明，益气消积方有较好的抑制人胃癌NKN?28细胞生长的作用，且这种抑瘤作用呈现出时间、浓度依赖性。
【】
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