碱性成纤维细胞生长因子在前列腺癌和良性前列腺增生组织中表达的意义

           作者：刘艳波　沈维高　赵雪俭

【摘要】  目的 探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 在前列腺癌和良性前列腺增生组织中表达的意义。方法　采用斑点杂交和免疫组化法测定50 例正常前列腺组织(正常对照组)、40 例良性前列腺肥大(BPH)组织和48 例前列腺癌组织中bFGF 的表达情况。结果 BPH和前列腺癌组织中bFGF的表达明显高于正常对照组(P＜0?01)。bFGF 表达升高的程度与BPH的分度、前列腺癌的病理分级和临床分期关系不显著。结论 bFGF 与前列腺癌和前列腺增生的发生过程有关。

【关键词】  前列腺增生；前列腺癌；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)

　　前列腺癌和前列腺增生是老年男性常见疾病。近年来研究资料表明前列腺癌和前列腺增生组织中存在许多分子表达异常，但是对其发病机制尚缺乏统一的认识〔1,2〕。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一种常见的内皮细胞分裂原，通过自分泌或旁分泌机制促进血管的生成、组织再生、抑制细胞凋亡及增强细胞侵袭能力等，与许多疾病的发生发展关系密切。研究结果显示bFGF在前列腺癌和前列腺增生的发病过程中也发挥重要的作用〔3～7〕。我们采用斑点杂交和免疫组化染色方法,观察了bFGF 在正常前列腺、良性前列腺增生(benign prostate hyperplasia，BPH)和前列腺癌组织中的表达及其与临床的关系,并探讨其临床意义。

　　1 材料与方法

　　1?1 材料           

　　选取吉林大学第三临床手术切除的BPH标本40例，年龄55～73（平均62）岁。Rous分度:Ⅰ度8 例,Ⅱ度12例，Ⅲ度9例，Ⅳ度11例。前列腺癌标本48 例，年龄54～71（平均66) 岁。WHO分级：高分化15例，中分化19例，低分化14例；Whitmore?Jewett 分期：A期12例,B期10例，C期16例，D 期10例。另取50例意外死亡者的正常前列腺标本作为对照，年龄36～59 （平均49）岁。

　　1?2 试剂           

　　荧光素标记试剂盒购自华美公司。鼠抗人bFGF 单抗(mAb) 购自Invitrogen 公司。兔抗鼠IgG和ELISA试剂购自福州迈新生物试剂公司。限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅡ购自宝生物公司。DAB显色试剂盒购自南京建成生物试剂公司。

　　1?3 方法

　　1?3?1 正常前列腺、BPH 和前列腺癌的斑点杂交           
　　①探针制备和标记：bFGF 质粒转化、扩增及提取，参照〔4〕方法进行，所得bFGF 质粒经EcoRⅠ和HindⅡ酶切回收探针片段。探针标记采用荧光素标记试剂盒随机引物法。②细胞总RNA 提取：采用异硫氰酸胍一步法。③RNA斑点杂交：以相同浓度总RNA点膜。④检测：采用试剂盒发光自显影法检测，显影胶片应用机图像分析技术测定斑点平均吸光度( A) 值。

　　1?3?2 正常前列腺、BPH 和前列腺癌的免疫组化染色           
　　鼠抗人bFGF mAb 孵育前，用微波炉进行抗原修复10 min，鼠抗人bFGF mAb 的工作浓度1∶100。用PBS 代替鼠抗人bFGF mAb 作为阴性对照，以DAB显色，透明封片。

　　1?4 判定标准           

　　所有阳性染色特征为棕黄色颗粒，位于细胞胞质内。随机观察5～10 个视野，计算100 个腺上皮细胞或癌细胞阳性细胞数，取其均值。阳性细胞数＜10%者(-)，10%～29%者(+)，30%～59%者(?)，≥60%者(?)。

　　1?5 统计学处理           

　　应用SPSS10?0软件包进行统计分析，数据用x±s表示，采用χ2及秩和检验。

　　2 结果

　　2?1 各组bFGF mRNA表达量比较           

　　正常对照组中bFGF mRNA表达量低（23±11）， BPH组（178±29）和前列腺癌组（265±24）中bFGF mRNA表达较高。前列腺癌及BPH组织中mRNA表达水平与正常对照组之间比较差异显著(P＜0?05) 。

　　2?2 不同分化程度的BHP组织中bFGF mRNA表达水平比较           
　　BHPⅠ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度组织bFGF mRNA表达水平(pg/μl)分别为197±24（n=8）、186±27（n=12）、169±22（n=9）、188±31（n=11）。经方差分析,4组组间bFGF mRNA的表达无明显差异,提示bFGF mRNA的表达与BPH的分化无明显关系。

　　2?3 不同分化程度的前列腺癌组织中bFGF mRNA表达水平比较           
　　高、中、低分化的前列腺癌组织中bFGF mRNA表达水平(pg/μl)分别为273±28（n=15）、261±29（n=19）、254±20（n=14）。经方差分析,三者bFGF mRNA的表达无明显差异,提示bFGF mRNA的表达与前列腺癌的病理分级无明显关系。

　　2?4  各组免疫组化染色结果比较           

　　见图1。正常对照组 bFGF呈阴性,BPH组阳性表达率为72?5%(29/40)，与正常对照组比较差异显著(P＜0?05) 。BPH阳性病例中,阳性染色主要位于基质细胞。前列腺癌组bFGF 的表达率为76?7%(36/48)，其中“+”15 例,“?”19例,“?”14例，阳性染色位于癌细胞质,与正常对照组比较差异显著(P＜0?05) 。bFGF 的染色强度与前列腺癌的病理分级、临床分期及BPH 的分度均无图1            各组组织中bFGF免疫组化染色
明显关系(P＞0?05)。

　　2?5 不同Whitmore?Jewett 分期的前列腺癌组织中bFGF mRNA表达水平比较          

　　A、B、C、D各期的前列腺癌组织中bFGF mRNA表达水平(pg/μl)分别为248±31（n=12）、259±19（n=10）、264±26（n=16）、257±28（n=10）。经方差分析,4组组间bFGF mRNA的表达无明显差异,提示bFGF mRNA 的表达与前列腺癌的临床分期无明显关系。

　　3 讨 论
                       
　　bFGF基因位于人的第5对染色体上，为单拷贝基因，呈不连续状态，其功能区被两个内含子隔开分为3个外显子区域。bFGF基因长度大于38 kb，第一个内含子位于第60、61位密码间，第二个内含子位于第94、95位密码子之间。bFGF主要分布于垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、胎盘等，尤以垂体含量最高。bFGF作为细胞分裂原，主要作用于起源于中胚层和神经外胚层的骨骼肌细胞、成纤维细胞和骨细胞等，其受体也相应分布于上述细胞表面。bFGF 是由146 个氨基酸组成的多肽生长因子,其在体内的形式为相对分子质量分别为16、18?5和24 kD等几种同种异构体。
                       
　　我们应用斑点杂交法发现，bFGF mRNA 在正常前列腺组织中表达量非常低，在BPH组织和前列腺癌组织中高表达较高。通过免疫组织化学染色发现，bFGF主要存在于前列腺癌的基质细胞中〔6〕，少量在细胞上皮内存在。其机制可能是IL?1和IL?8 诱导bFGF表达在BPH的发生中起着至关重要的作用〔2〕，另外，bFGF还可激活多种信号转导通路，包括磷脂酰肌醇?3激酶（Akt）通路，Ras?MAP激酶通路，蛋白激酶?C(PKC)依赖的信号转导通路，从而促进肿瘤的发生及发展〔8〕。体外细胞培养发现，雄激素与PC?3细胞表面的雄激素受体结合后，可促进其分泌bFGF结合蛋白,活化PC3细胞分泌bFGF，从而促进前列腺癌细胞增殖，并维持雄激素受体表达〔9〕。
                       
　　本研究结果显示，bFGF mRNA 的表达与BPH 的分化、前列腺癌的临床分期及病理分级，均无明显的相关性(P＞0?05)。Boget等〔10〕通过RT2PCR 法研究发现，BPH 组织中bFGF mRNA 的表达较正常前列腺组织中高2～3倍，在前列腺癌组织中bFGF mRNA 同样呈过度表达。邱建新等〔11〕通过半定量RT?PCR 法研究发现，BPH 组织中FGF mRNA的表达明显高于正常前列腺组织，bFGF mRNA转录是重要的促细胞分裂原，可通过自分泌或旁分泌方式作用细胞，促进细胞的分裂和增殖。bFGF在前列腺组织中表达增加与细胞增生和细胞增殖关系密切，其机制有待于进一步探讨。

【】
  　　1 Deshmukh N，Scotson J，Dodson AR,et al?Differential expression of acidic and basic fibroblast growth factors in benign prostatic hyperplasia identified by immunohistochemistry〔J〕?Br J Urol，1997;80:869?74?

　　2 Giri D，Ittmann M?Interleukin?8 is a paracrine inducer of fibroblast growth factor 2，a stromal and epithelial growth factor in benign prostatic hyperplasia〔J〕?Am J Pathol，2001;159:139?47?

　　3 Sinowatz F，Schams D，Einspanier R,et al?Cellular localization of fibroblast growth factor 2 (FGF?2) in benign prostatic hyperplasia〔J〕?Histol Histopathol，2000;15:475?81?

　　4 Giri D，Ittmann M?Interleukin?1alpha is a paracrine inducer of FGF7，a key epithelial growth factor in benign prostatic hyperplasia〔J〕?Am J Pathol,2000;157:249?55?

　　5 Giri D，Ittmann M?Interleukin?8 is a paracrine inducer of fibroblast growth factor 2，a stromal and epithelial growth factor in benign prostatic hyperplasia〔J〕?Am J Pathol，2001;159:139?47?

　　6 Karsten Gravdal，Halvorsen OJ，Haukaas SA,et al?Expression of bFGF/FGFR?1 and vascular proliferation related to clinicopathologic features and tumor progress in localized prostate cancer〔J〕?Virchows Arch，2006;448:6874?

　　7 Yuebo Gan，M?Guillaume Wientues，Jessie L?S?Au?Expression of basic fibroblast growth factor correlates with resistance to paclitaxel in human patient tumors〔J〕?Pharmaceutical Research，2006；23 (6)：1324?

　　8 Friesel RE，Maciag T?Molecular mechanisms of angiogenesis：fibroblast growth factor signal transduction〔J〕?FASEB J,1995;9(10):919?25?

　　9 Giri D，Ropiquet F，Ittmann M?Alterations in expression of basic fibroblast growth factor (FGF) 2 and its receptor FGFR?1 in human prostate cancer〔J〕?Clin Cancer Res，1999；5:1063?71?

　　10 Boget S，Leriche A，Revol A?Basic fibroblast growth factor and keratinocyte growth factor over?expression in benign prostatic hyperplasia〔J〕?Farmaco，2001;56:467?9?
　　11 邱建新,邹炼，李荣?成纤维细胞生长因子10 在前列腺增生组织中的表达〔J〕?细胞与分子免疫学杂志，2002；18(6):595?7?