分析谷胱甘肽
作者：赵利娜，陶佳，赵运胜，廖飞
【关键词】 积分法；动力学酶法分析；还原型谷胱甘肽；谷胱甘肽
摘要：目的 以谷胱甘肽S转硫酶(GST)为模型，探讨有产物抑制时用积分法分析酶反应过程测定底物量的可靠性。方法 从猪肝制备GST。1氯2,4二硝基苯(CDNB)终浓度为1.0mmol/L，监测GST催化还原型谷胱甘肽(GSH)与CDNB结合产物在340nm吸收变化。用积分法预测反应终点的产物吸收。结果 优化产物抑制常数可使此积分法所得反应终点产物吸收对剩余底物变化不敏感。此积分法测定GSH对常见干扰有抗性。此法测定大鼠肝匀浆中外加GSH回收率大于98%，线性响应上限接近90μmol/L，下限接近2.0μmol/L，所得大鼠肝GSH含量与报道一致。结论 有产物抑制时用积分法也可定量底物；用此积分法进行动力学酶法分析具有一定普遍性，而且有明显优势。
关键词：积分法；动力学酶法分析；还原型谷胱甘肽；谷胱甘肽S转硫酶；1氯2,4二硝基苯
Quantification of reduced glutathione by analyzing glutathineStransferasereaction process taking into account of product inhibition)
ABSTRACT: Objective To investigate the reliability of the integrated method for kinetic assay of substrate in the presence of product inhibition using glutathioneStransferase(GST) as model. Methods Purified GST from pig liver was used to catalyze the conjugation of reduced glutathione (GSH) to 1chloro2,4dinitrobenzene (CDNB) (final concentration at 1.0mmol/L), and reaction curve was monitored by product absorbance at 340nm. Maximal product absorbance after the completion of reaction was predicted by the integrated method. Results The optimization of product inhibition constant conferred to resistance to the variation of residual substrate concentration on the estimation of maximal product absorbance. This integrated method for kinetic substrate assay was also resistant to common source of errors. The recovery for extra GSH in rat liver homogenate was above 98% with linear response ranged from 2.0μmol/L to 90 μmol/L. The concentration of GSH in rat liver was consistent to previous reports. Conclusion The integrated method is valid for kinetic assay of substrate when there is product inhibition, and it exhibits some universality as a kinetic method for enzymatic analysis with obvious advantages.
KEY WORDS:integrated method; kinetic enzymatic analysis; reduced glutathione; glutathioneStransferase; 1chloro2,4dinitrobenzene
还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)有重要生理功能[1]。用Ellman试剂(2, 2双(4硝基2羧基)二硫化物，DTNB)反应或高效液相层析(HPLC)可测定GSH[23]，但巯基化合物对DTNB法干扰显著，HPLC定量GSH受到仪器和效率限制。测定谷胱甘肽S转硫酶(glutathione Stransferase, GST)催化GSH与1氯2,4二硝基苯(CDNB)结合产物的吸收也可定量GSH，此法简单易行，不受巯基化合物干扰[4]。但至今用GST测定GSH都用终点平衡法，其效率比动力学酶法分析低而成本高。本实验室建立的积分法，即用以反应时间为自变量的积分速度方程拟合反应曲线分析酶反应过程，可用于动力学酶法分析定量无产物抑制时不可逆酶反应体系的底物，其可测范围宽，抗干扰能力强[59]。但对存在产物抑制的复杂体系此积分法是否有效还未确定。GST反应存在明显产物抑制[10]。本实验用GST测定GSH为模型，考察此积分法用于有产物抑制的反应体系进行动力学酶法分析定量底物的可靠性，以明确此积分法用于酶法分析的通用性。
1 材料与方法
1.1 材料 GSH、半胱氨酸、β巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)、2,2双(4硝基2羧基)二硫化物 (DTNB)均购自Sigma公司，2,4二硝基氯苯(CDNB)购自ICN，磷酸纤维素P11购自Whatman，其余试剂为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 GST的制备 操作均在4℃下进行。市售新鲜猪肝150g用10.0mmol/L TrisHCl缓冲液(pH7.8，含250mmol/L蔗糖，1.0mmol/L EDTA，0.50mmol/L DTT)按1∶2匀浆；离心后上清用45%-85%硫酸铵分级；沉淀溶解透析后上磷酸纤维素柱，相同缓冲液洗去疏松结合蛋白，含0.2mol/L NaCl的缓冲液洗脱活性部分。用0.2mmol/L GSH和CDNB在25℃测定酶活性，据340nm吸光度变化按9.6mmol/(L・cm)产物生成速度[11]。
1.2.2 反应过程监测 反应体系为0.1mol/L磷酸缓冲液(pH6.5) 2.0mL，50μL CDNB无水乙醇溶液 (终浓度为1.0mmol/L)，稀释样品0.35mL，记录340nm初始吸收(A0，相当于本底)，再加入5μL酶液[反应体系GST活性高于0.03mmoL/(min・L)]启动反应，延迟30s后以10s间隔记录吸光度变化，直到吸光度变化小于0.001或最大吸光度达到1.200。同时记录反应30min后的吸光度为终点平衡法的结果。标准GSH溶液用DTNB法校正。用50μmol/L GSH测定半胱氨酸、巯基乙醇、DTT等的干扰。
1.2.3 GST反应曲线分析 GSH低于100μmol/L时GST反应为乒乓机制[1012]。在GSH低于100μmol/L而CDNB为1.0mmol/L时GST可近似为单底物反应。按乒乓机制的微分速度方程积分乘以反应时间为自变量的形式[10,13]，除了产物抑制常数Kiq以外均采用文献中提供的参数。以反应体系的最大吸收(Am)为非线性参数，用于拟合启动反应40s后6个以上吸光度变化大于0.001的数据搜索对应最好拟合的Am为待测参数。底物浓度太低造成反应5min后没有6个以上吸光度变化大于0.001的数据，则用反应5min 后吸收加0.001为Am。产物净吸收为(Am-A0)。反应曲线拟合所需程序用Visual Basic 6.0 编写，数据记录成文件读入，作图鉴别畸异值，结果输出到指定文本文件。
1.2.4 大鼠肝匀浆GSH浓度测定 Wistar大鼠全麻后取肝脏，称重后用4℃预冷磷酸盐缓冲液(pH 6.5，含0.50mmol/L DETAPA)制成30%匀浆，离心后上清用高氯酸沉淀蛋白质，等体积二氯甲烷去色素后离心，上清用3mol/L 磷酸钾调节pH至中性，再离心后取适量(约30μL)上清按前述操作测定反应曲线。
1.2.5 蛋白质测定 用双缩脲法测定肝匀浆蛋白质量浓度[14]。
1.2.6 统计学处理 结果用±s表示，SAS8.2作统计分析，P<0.05为有统计学意义。
2 结果和讨论
2.1 积分法预测终点产物吸光度的影响因素 1.0mmol/L CDNB在340nm有较高吸光度，需此CDNB本底吸光度(A0)才能确定产物净吸收。反应体系CDNB浓度基本不变，但CDNB醇溶液加样重复性较低，A0波动大(0.495±0.019,n=6)。独立测定GST作用前的A0可有效提高确定产物吸收的精度(数据省略)。CDNB浓度为1.0mmol/L时双倒数法得GST对GSH米氏常数(Km)为(0.21±0.02)mmol/L(n=4)，GSH浓度为1.0mmol/L时其对CDNB的Km为(62±3)μmol/L(n=4)，均与结果一致[1011]。故用此积分法预测产物吸收时，除产物抑制常数(Kiq)外均采用文献参数。反应体系初始GSH高于50μmol/L时，反应2.5min后剩余底物接近10.0μmol/L，反应5.0min后剩余底物仍高于5.0μmol/L。CDNB与GSH加合物对大鼠肝碱性GST的Kiq接近7.0μmol/L[10]。用此积分法分析初始GSH略大于50μmol/L时启动反应40s后(起点底物接近27μmol/L)的反应曲线发现，此积分法对Kiq偏差的敏感性受终点剩余底物的显著影响。终点底物接近10.0μmol/L时，预设Kiq为4.0μmol/L时所得结果与终点平衡法偏差小于1.5%，预设Kiq为7.0%μmol/L或2.0μmol/L时所得结果偏差接近3%，不计产物抑制则所得结果降低约10%；终点底物接近5.0μmol/L时，预设Kiq从2.0μmol/L上升到7.0μmol/L所得结果与终点平衡法偏差均低于2.0%，不计产物抑制则所得结果降低不到3.5%；当剩余底物低于初始底物的2%时，即使不计产物抑制所得结果与终点平衡法偏差也只有1%。可见只要剩余底物足够低则此积分法对Kiq不敏感；当被分析终点底物较高(接近起点的30%)时，优化Kiq也可使此积分法有效，这与模拟分析无产物抑制的酶反应体系结果一致[6]。积分法所允许终点底物越高，则分析样品所需时间越短；优化Kiq使此动力学有效，则用GST活性测定样品所需时间只有终点平衡法的10%，可显著提高分析效率。因此，对此积分法优化所需要的Kiq是必要的。
2.2 线性响应曲线和抗干扰能力 将Kiq固定为4μmol/L分析反应5.0min内数据，此积分法测定10、20、60μmol/L GSH的变异系数小于5%(n=5)。对50μmol/L的GSH，将酶活性降低30%后此积分法所得结果仍无显著差异(数据省略)。巯基化合物等干扰物质对此积分法预测最大产物吸收都无干扰 (表1)。分析产物吸收对4.0-70.0μmol/L GSH的响应，其回归估计标准差约0.008。以回归估计标准差的两倍为下限，则可测下限接近2.0μmol/L。以1.200为吸收上限，用对应条件下的GST终点平衡法可测GSH上限约为75μmol/L。降低酶活性使反应40s后GSH大于初始浓度80%并分析剩余GSH低于被分析起点25%的反应曲线，此积分法测定外加90μmol/L GSH的产物净吸收与根据此方法对70μmol/L 以下GSH响应曲线推算结果的偏差仍小于1.2μmol/L。可见此积分法用于动力学酶法分析定量底物的线性范围可达到90μmol/L GSH，高于用终点平衡法时仪器直接测定上限。分析4-70μmol/L GSH 时反应5.0min内的数据，积分法所得结果与终点平衡法无差异(配对t检验，表2)。对相同体系积分法结果对终点平衡法结果的回归方程基本通过原点，且二者之间的比值(斜率)与1无差异；Bland Altman分析亦表明两种方法无差异；积分法所得GSH与用DTNB法所得也无差异(数据省略)。因此，此积分法能用于动力学酶法分析可靠测定GSH，并有更宽的线性范围和更高效率。
表1 常见干扰物质对用该积分法测定GSH的影响（略）
Table 1 The effects of common interfering substances on GSH assay by the integrated method
表2 产物抑制常数(Kiq)对该积分法测定GSH的影响（略）
Table 2 The effects of product inhibition constant (Kiq, μmol/L) on GSH assay by the integrated method
All assays were in triplicate. *P<0.05 vs. the endpoint method; **P>0.05 vs. the endpoint method; △P>0.05 vs. DTNB method
2.3 大鼠肝匀浆中GSH的测定 将Kiq固定为4μmol/L分析反应5.0min内的数据，此积分法测定大鼠肝匀浆中外加1.5mmol/L GSH的回收率为(100±3)%(n=6)，4.5mmol/L GSH的回收率为(101±2)%(n=6)；大鼠肝中GSH浓度为(16.6±1.8)μmol/g 蛋白(n= 4，相当于3.5μmol/g 肝组织)，也与文献报道一致[14]。故此积分法能快速可靠测定肝组织GSH浓度。用DTT还原GSSG为GSH后用此方法还可测定GSSG，但需要独立测定DTT带来的本底。
综上所述，对于单底物不可逆酶反应体系，只要获得其以反应时间为自变量的积分速度方程和有效参数，存在产物抑制时此积分法仍能用于动力学酶法分析测定底物含量。用积分法预测终点的动力学酶法分析方法效率高，成本低，酶活性变化无干扰，上限高于工具酶Km，甚至可高于仪器可测上限，产物抑制也无干扰，有明确应用价值。
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