慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征患者外周血Th1/Th2淋巴细胞比值的免疫学研究

                  作者：刘大标，王洪珍，成晓青，顾红兵，孟子裕 

【摘要】  目的：探讨慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征（CAP/CPPS）患者外周血Th1/Th2细胞分布的变化情况，了解其在CAP/CPPS发病过程中的意义。方法：采用流式细胞学检测40例CAP/CPPS患者和20例健康体检者外周血CD3+ CD8?T细胞内细胞因子干扰素γ（IFN?γ）和白细胞介素（IL?4）的表达。结果：与正常对照相比，Ⅲa型、Ⅲb型CAP/CPPS患者的Th1细胞数均升高，Th1/Th2比值升高，差异有显著性（P<0.05），Th2细胞数差异无显著性（P>0.05）。结论：CAP/CPPS患者Th1/Th2平衡失调，Th1型免疫反应模式占优势状态，提示Th1细胞在CAP/CPPS的疾病发生中可能起重要作用。

【关键词】  慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征；Th1/Th2；流式细胞仪

　　Detection of Peripheral Blood Th1/Th2 Cell Ratio in Patients with Chronic Abacterial Prostatitis /Chronic Pelvic Pain Syndrome

　    Abstract: Objective To investigate the change of peripheral Th1/Th2 cells in patients with CAP/CPPS and evaluate its in the etiology of CAP/CPPS. Methods Interferon?γ (IFN?γ) and interleukin?4(IL?4) secreted by CD3+CD8? T cells were detected by flow cytometry in 40 patients with CAP/CPPS and 20 healthy volunteers. Results Compared with control group ,peripheral Th1 cells were significantly increased in patients with Ⅲa and Ⅲb CAP/CPPS. The Th1/Th2  cells ratio was apparently creased (P<0.05), while Th2  cells was not different from that in the control (P>0.05). Conclusion There is a Th1/Th2 imbalance in CAP/CPPS patients with an increase of Th1 type cytokines, Th1 cell may play an importantrole in the pathogenesis of CAP/CPPS.

    Key words: CAP/CPPS;Th1/Th2;flow cytometry

    慢性非细菌性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征（CAP/CPPS）是1995年美国卫生研究院［1］（NIH）建立的慢性前列腺炎（CP）分类标准中的一类，即为传统分类法中的非细菌性前列腺炎和前列腺痛，约占前列腺炎综合征的90%~95%，它又分为炎症型（Ⅲa）和非炎症型（Ⅲb）。其病因和发病机制尚不明确［2］，已有的研究表明，免疫反应参与了CP的发病机制［3，4］，但以往的研究多集中于细胞因子与CP的关系，有关免疫细胞与CP的关系报道甚少。近年来关于Th1/Th2细胞在免疫性疾病中的功能变化研究进展非常迅速，Th1/Th2极化是免疫应答的关键环节，Th1/Th2极化异常或缺陷均可导致疾病。为探讨CPPS患者外周血Th1/Th2细胞分布变化情况，我们用流式细胞仪检测40例CAP/CPPS患者外周血CD3+CD8?T细胞内细胞因子IFN和IL?4的表达，现报道如下。

　　1  资料与方法

　　1.1  研究对象 

　　选择2006年1月至2006年12月在镇江市第四人民、第一人民医院男科就诊的具有完整病史，诊察记录并符合NIH前列腺炎诊断标准的40例CAP/CPPS患者为研究对象。标准为：有会阴部或腰骶部等部位疼痛；不同程度的排尿刺激症状、流白或性功能障碍等；病程>3个月；直肠指检前列腺可有大小不等、质地不均和结节改变；B超检查无明显前列腺增大及占位病变，其中，18例前列腺液（EPS）检查白细胞≥10个/HP，前列腺按摩前后（PPMT）二次尿培养阴性，无细菌生长，为Ⅲa型前列腺炎，年龄19岁~58岁，平均年龄（39.3±10.5）岁；22例EPS检查白细胞<10个/HP，PPMT尿培养阴性，为Ⅲb型前列腺炎，年龄18岁~63岁，平均年龄（38.7±12.3）岁。选择同期健康男性体检者为健康对照，年龄18岁~45岁，平均年龄（36.4±8.1）岁，均无任何临床症状，经过全面体格检查及生殖器官检查无异常，EPS常规白细胞<10个/HP。所有测试者就诊前4周内未服用过免疫调节药物，并排除肝、肾、糖尿病及其他免疫性疾病。

　　1.2  试剂和仪器 

　　美国Biosciences公司提供荧光单克隆抗体CD3?PC5/CD8?FITC，细胞因子抗体抗人IL?4?PE、抗人IFN?γ?PE、相应的同型对照及Fix&Perm破膜剂。美国Sigma公司提供的佛醇乙酯（PMA），离子霉素（Ionomycin），蓝菌素A（BFA），RPMⅡ640。流式细胞仪为美国BECKMAN COULTER型流式细胞仪。CO2培养箱为德国Heraeus 。

　　1.3  实验方法
 
　　取肝素抗凝的新鲜外周血100 μl加入RPMII640培养液100 μl混匀。分别加入刺激剂PMA和Ionomycin,使其终浓度分别为25 ng/ml和1 μg/ml,同时加入工作浓度为10 μg/ml蛋白转运阻断剂BFA，未刺激对照组只加BFA，不加刺激剂，混匀后细胞在37℃，5%CO2培养箱培养4 h；培养全血再分别进行细胞表面抗原标记，破膜及细胞内因子染色，在试管中加入10 μl CD3?PC5和10 μl CD8?FITC，各管分别加入100 μl培养全血，混匀，室温暗处孵育15 min；用破膜剂Fix&Perm中的A液100 μl固定；再加入3 ml pH 7.4的0.01 mol/L PBS缓冲液，混匀，分成A1、A2两管，1 200 r/min离心5 min，弃去上清，每管加入50 μl Fix&Perm中的B液破膜和溶血，孵育5 min，然后各管中分别加入10 μl抗人IFN?γ?PE及10 μl抗人IL?4?PE，室温暗处孵育15 min,每管加入1.5 ml PBS,1 200 r/min离心5 min,弃上清，0.5 ml PBS重悬细胞，2 h内上机检测。

　　1.4  数据获取及分析 

　　用CD3+CD8?设门圈定CD4+T细胞群，收集1 104个细胞，用Cellquest软件进行数据分析，得出Th1（CD3+CD8?/ IFN?γ+）和Th2（CD3+CD8?/IL?4+）的百分率及Th1/Th2细胞的分布。

　　1.5  统计学分析

　　数据以(±s)表示，用SPSS 11.5统计软件进行配对t检验。

　　2  结果

    CPPS患者外周血Th1细胞显著多于Th2细胞，与正常对照组比，Ⅲa型、Ⅲb型CPPS患者的Th1细胞数及Th1/Th2比值均升高，差异显著（P<0.05），Th2细胞数差异无显著性（P>0.05）；而Ⅲa型与Ⅲb型患者比较，其Th1、Th2细胞数及Th1/Th2比值差异无统计学意义（P>0.05），见图1, 表1。表1  CAP/CPPS患者与对照组外周血Th1/Th2比值（略）注：与正常对照组相比*P<0.05。

　　3  讨论

    慢性前列腺炎（CP）是一种好发于男性青壮年的常见病，仅有5%~10%可找到细菌感染的证据［5］，其余大多数病因和发病机制尚不清楚，由于其症状多变，诊断标准和方法不统一，患者虽经长期治疗，但效果不佳，严重影响其生活质量。近年来，免疫与前列腺炎的关系引起了较多的关注［3］。男性生殖道是一个免疫优势部位，任何生殖系统（包括前列腺）损伤，如泌尿道感染、急性细菌性前列腺炎和创伤等都增强自身免疫反应，因此自身免疫和T细胞增殖反应可能参与了CAP/CPPS的发病过程。Batstone等［6］通过研究CPPS患者与对照组外周血单个核细胞增殖与连续稀释的精浆反应情况，有力支持了自身免疫学说。机体维持正常的免疫功能状态依赖于多种免疫细胞（特别是T细胞亚群）及细胞因子之间相互协调的结果，以产生适度的免疫应答清除异物抗原，又不损伤自身组织。辅助性T细胞（Th）可分为Th0、Th1和Th2细胞，在生理条件下，Th1/Th2处于相对平衡状态，Th1/Th2平衡调节对维持机体免疫状态起重要作用，Th1细胞主要为泌IL?2、IL?12、IFN?γ等细胞因子促进细胞免疫，而Th2细胞主要分泌IL?4、IL?5、IL?10等细胞因子调节体液免疫，Th1/Th2比例失衡即极化异常与许多疾病发生和转归有关。本实验结果显示Ⅲa和Ⅲb型患者Th1细胞数和Th1/Th2比值均比对照组明显升高，差异显著，提示免疫因素参与了CAP/CPPS的发病过程，CAP/CPPS的发生与免疫增强有一定关系，Th1型反应模式处于优势状态，Th1/Th2极化异常。

    近年来关于Th1/Th2细胞在免疫性疾病中的功能变化研究进展非常迅速，这些研究初步阐明了人类Th1/Th2细胞的生理和病理作用，极大地提高了人们对细胞因子的认识，并为Th1或Th2介导的免疫性疾病的临床治疗提供了理论依据，如果能人为的选择性诱导或调控Th1/Th2细胞的免疫反应，促进Th1/Th2细胞反应的动态平衡将十分有利于疾病的转归。根据CAP/CPPS患者外周血Th1/Th2细胞分布变化情况设计治疗方案，调整机体Th1/Th2的相对平衡状态，使免疫反应由Th1型向Th2型转变将有助于临床治疗CAP/CPPS。Th1和Th2细胞通过分泌各种细胞因子形成网络系统互相协调互相制约各种免疫反应并处于动态平衡之中。因此可以在充分考虑细胞因子作用的多样性和复杂性的基础上，进行类似过敏性哮喘［7］、自身免疫性疾病、移植免疫等疾病的免疫治疗的尝试。

【】
  　　［1］Chronic Prostatitis Workshop. National institutes of health ［M］. Bethesda, Maryland,1995:7?14.

　　［2］唐孝达. 慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征诊治中值得商榷的问题 ［J］.中华男，2003，9（6）：403?406.

　　［3］周晓辉，韩 蕾，周智恒，等. 免疫性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的形态学与分子生物学特性 ［J］.中华男科学杂志，2005，11（4）：290?295.

　　［4］李宏军，尚学军，黄宇烽. L?10、L?8在慢性前列腺炎中的改变及意义 ［J］.中华男科学杂志，2004，10（7）：486?487.

　　［5］Alexander RB, Ponniah S, Hasday J, et al.Elevated levels of proinflammatory cytokines in the semen of patient with chronic prostatitis/ chronic pelvic pain syndrome ［J］. Urology, 1998,52(5):744?749.

　　［6］Batstone GR, Doble A, Gaston JS.Autoimmune T cell responses to seminal plasma in chronic pelvic pain syndrome (CPPS) ［J］.Clin Exp Immunol, 2002,128(2):302?307.

　　［7］兀 威，陈 萍，高 燕，等.白细胞介素?12对哮喘患者Th细胞的作用 ［J］.西安大学学报（医学版），2004，25（4）：393?396.