人肺腺癌细胞系A549细胞双向电泳?飞行时间质谱研究
作者：杨拴盈，田应选，南岩东，卜丽娜，霍树芬，阮禹松
【摘要】 目的 初步分析人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质表达情况，从蛋白组水平探讨肺腺癌发病的分子机制。方法 应用2?DE技术对人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白进行分离，获得蛋白质表达谱；应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI?TOF?MS)结合生物信息学进行蛋白质鉴定。结果 3块胶平均蛋白斑点数为1138±49，平均匹配点数为986±32，匹配率为85.8%。随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高的20个斑点进行MALDI?TOF?MS分析，共获得了18个肽质量指纹图谱(PMF)。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISS?PROT数据库，根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率等，初步鉴定出15种蛋白质。根据功能，这些蛋白质可分为：①基本代谢相关的酶类：果糖2?磷酸醛缩酶、视网醛脱氢酶1(RALDH1)、吡多醛激酶；②细胞骨架类：蛋白细胞角蛋白8(CK8)、β?2链微管蛋白；③应激相关蛋白：蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3)；④ 信号转导分子：膜联蛋白1(ANX1)、膜联蛋白4(ANX4)；⑤分子伴侣：热休克蛋白60(HSP60)、热休克蛋白β?1、抑制素(PHB)；⑥转录及翻译相关蛋白：不均一性核糖核蛋白H(hnRNP H)；⑦杂类：Rgr protein、NPM、PCBP1。结论 应用2?DE/MALDI?MS方法获得了较为理想的人肺腺癌细胞系A549细胞2?DE蛋白质表达谱，初步鉴定了15种蛋白质。
【关键词】 人肺腺癌细胞系；蛋白质组学；双向电泳；基质辅助激光解吸离子化电离飞行时间质谱；肽指纹图谱
A proteomic study on human lung adenocarcinoma cell line A549 by 2?DE and MALDI?TOF?MS
ABSTRACT: Objective To analyze protein profiles in human lung adenocarcinoma cell line A549 cell and to investigate molecular mechanism of pulmonary adenocarcinoma genesis at the level of proteomics. Methods Two dimensional gel electrophoresis (2?DE) was used to separate totally soluble proteins extracted from A549 cell, and peptide mass fingerprintings (PMFs) were obtained and then some spots on 2?DE gels were identified by matrix?assisted laser desorption/ionization time?of?flight mass spectrometry (MALDI?TOF?MS) combined with bioinformatics. Results The average total number of proteins spots was 1138±49, average paired spots 986±32, and matched rate 85.8% among the three gels. 20 spots with high resolution and reproducibility were analyzed using MALDI?TOF?MS, 18 spots yielded PMFs, and 15 proteins were preliminarily identified and further classified into 7 categories based on their functions: ① enzymes related to cell metabolism: fructose?bisphosphate aldolase A, retinal dehydrogenase 1(RALDH1), pyridoxal kinase; ② cytoskeleton proteins: type II cytoskeletal 8(CK8), tubulin beta?2 chain; ③ proteins related to stress: protein disulfide?isomerase A3 (PDIA3); ④ signal tranduction molecules: annexin A1(ANX1)and annexin A4(ANX2); ⑤ chaperones: 60ku heat shock protein(HSP60), heat shock protein beta?1, prohibitin(PHB); ⑥ proteins related to transcription and translation: heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H); ⑦ others: Rgr protein, nucleophosmin(NPM), poly(rC)?binding protein 1(PCBP1). Conclusion A clear, well?resolved protein profile in A549 cell was obtained by 2?DE and 15 proteins were identified using PMFs.
KEY WORDS: human lung adenocarcinoma cell line; proteomics; two dimensional gel electrophoresis; matrix?assisted laser desorption/ionization time?of?flight mass spectrometry (MALDI?TOF?MS); peptide mass fingerprinting
肺癌是目前全球范围内发病率最高的恶性肿瘤[1]，腺癌是肺癌中最主要的组织学类型之一。由于肺腺癌发病机制不明、转移早、对放疗及化疗不敏感，因此，已成为制约肺癌5年生存率的主要因素。近年来，由于蛋白质组学(proteomics)技术具有高通量、高重复性及高灵敏性等特点，能够从整体水平(蛋白)分析蛋白质的变化，故其已成为探讨肿瘤发病机制和筛选其早期诊断标志物的强有力工具[2?3]。在本研究中，我们应用双向电泳(two dimensional gel electrophoresis, 2?DE)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix?assisted laser desorption/ionization time?of?flight mass spectrometry, MALDI?TOF? MS)技术结合生物信息学方法，检测人肺腺癌细胞系A549细胞蛋白质的表达情况，旨在从蛋白水平探讨腺癌的发病机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人肺腺癌细胞系A549细胞引自西安大学生命与技术学院癌症研究所，用含10%(体积分数)小牛血清的RPMI?1640培养液进行传代培养。
1.1.2 主要仪器 UP 200s超声破碎仪(Dr.Hielscher GmbH)；Ultrospec 2100proUV/Visible Spectrometer (Amersham Bioscience)；IPGphor等电聚焦仪(Amersham Biosciences公司)；Hoefor SE600垂直电泳仪(Amersham Biosciences)；ScanMaker 8700 扫描仪(MICROTEC)；Model 250 pH计(Thermo Orion)；WR?2001型溶剂过滤器(上海嘉鹏科技有限公司)；Milli Q超纯水发生器(Millipore)；Voyager?DETM MALDI?TOF质谱仪(Applied Biosystems)；CentriVap Concentrator(Labconco公司)；凝胶图像分析软件ImageMaster(Amersham Biosciences公司)；超速低温离心机(德国Sigma公司)；冷冻真空干燥机(美国Heto公司)。CO2细胞培养箱(REVCO?ELITE?2)，倒置相差显微镜(NIKon/TMS)。
1.1.3 试剂 尿素(Urea)、硫脲(thiourea)、三羟基甲基氨基甲烷碱(Tris?base)、EDTA、Protease Inhibitor Mix、CHAPS、TX?100、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)均购自Promega公司；溴酚蓝、甘氨酸、过硫酸铵均购自美国AMRESCO；丙烯酰胺(Arc)、甲叉双丙烯酰胺、碘乙酰胺(iodoacetamide)、硝酸银、蛋白质组学级(proteomics grade)TPCK?胰蛋白酶(TPCK?trypsin)、胰蛋白酶、三氟乙酸(TFA)、基质α氰基?4?羟基肉桂酸(CHCA)均购自Sigma公司；低熔点琼脂糖、甲醇、冰乙酸、固相pH梯度干胶条(IPG strip, 13cm, pH3-10)、IPG缓冲液(pH3-10)均购自Amersham PharmaciaBiotech公司；低分子量标准蛋白质购自上海伯奥生物制品公司；甘油、碳酸氢铵等其余试剂均为国产分析纯；新生小牛血清购自杭州四季青有限公司，RPMI?1640培养基购自GIBCO公司。所有溶液均用Milli Q水配制。
1.2 方法
1.2.1 细胞总蛋白的提取 用含10%(体积分数)小牛血清的RPMI?1640培养基进行传代培养A549细胞。待细胞生长至对数生长期时，胰酶消化，室温1000r/min离心10min，弃上清，重复3次；将1×107个细胞重悬于100μL预冷裂解缓冲液(8mol/L urea， 40g/L CHAPS，40mmol/L Tris?base，65mmol/L DTT，0.5% Pharmalyte pH3-10，1mmol/L PMSF)中，在4℃静置30min；冰浴中超声破碎10s(每次5s，间隔5s)；4℃ 15000r/min离心20min，取上清；Bradford 法蛋白定量，分装，-80℃冻存备用。
1.2.2 2?DE 用13cm固定胶条(pH3-10)，上样量45μg。参照IPGphor等电聚焦系统指南进行。最大电流60μA/IPGstrip；水化和聚焦在20℃自动进行。总电压时间积30000Vh，最后在8000V下进行等电聚焦。将胶条进行两步平衡后，移至12.5%分离胶的上端，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)。电泳完成后，按蛋白质银染试剂盒的操作手册进行银染。
1.2.3 凝胶图像分析 图像扫描后，在ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件辅助下，进行背景消减、点检测、匹配、获取斑点位置坐标等分析。
1.2.4 质谱分析 对银染蛋白点进行胶内酶切，脱色，还原，烷基化，酶解(用 TPCK?胰蛋白酶)、萃取及冻干，将制备好的样品置于Voyager?DE MALDI?TOF质谱仪上进行分析。采用线性模式、正离子谱测定，离子源加速电压为20kV，离子延迟提取500ns，质谱信号单次扫描累加50次，以多肽质量标准(ABI公司)为外标。
1.2.5 肽质量指纹图谱的数据库查询 将结果通过Aldente软件进行肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprintings, PMF)查询。数据库选择SWISS?PROT，PMF中的肽片段质量控制在1000-5000，肽片段分子质量最大容许误差(Peptide tol.)控制在±0.5u，Enzyme选择胰酶，酶解片段不完全(missed cleavages)选择为1个，物种来源(taxonomy)选择人类，离子选择[M+H]+和平均(average)，固定修饰(fixed modifications)选择脲甲基半胱氨酸(carbamidomethyl?Cys)。
2 结果
2.1 人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白的2?DE图谱 图1为A549细胞总蛋白的银染2?DE图谱。在相同条件下，对A549细胞总蛋白进行了3次2?DE检测。经图像扫描后，应用ImageMaster 2D Elite 4.01分析软件对图像进行分析，结果显示3块胶的平均蛋白斑点数为1138±49，用其中1块胶作为胶进行匹配，平均匹配点数为986±32，匹配率为85.8%。
图1 人肺腺癌细胞系A549细胞总蛋白双向电泳图谱（略）
Fig.1 2?DE gels of total protein extracts from human lung adenocarcinoma cell line A549
2.2 蛋白质斑点的MALDI?TOF?MS分析 从3块胶上匹配的蛋白点中随机选取背景清晰、分辨清楚、蛋白含量较高、重复性较好的20个斑点进行质谱分析。共获得了18张PMF。图2是1号蛋白质点的PMF。
2.3 数据库查询鉴定蛋白质 对20个蛋白点进行MALDI?TOF?MS分析。结果显示，大多数PMF图背景很低，峰信号较强，以1000-5000之间的片段峰较多。将PMFs质量数据通过Aldente软件查询SWISS?PROT数据库，根据匹配片段及氨基酸序列覆盖率，结合表观Mr及pI，初步鉴定出15种蛋白质(表1)。2个点未获得PMF，2个PMF未搜索到匹配的蛋白质。初步鉴定的15种蛋白质根据功能可分为：①基本代谢相关的酶类[fructose?bisphosphate aldolase A(果糖2?磷酸醛缩酶)，retinal dehydrogenase 1(RALDH1，视网醛脱氢酶1)，pyridoxal kinase(吡多醛激酶)]；②细胞骨架类蛋白[type II cytoskeletal 8(CK8，细胞角蛋白8)，tubulin beta?2 chain(β?2链微管蛋白)]；③应激相关蛋白[protein disulfide?isomerase A3 (PDIA3，蛋白二硫化物异构酶A3)]；④信号转导分子[annexin A1(ANX1，膜联蛋白1)，annexin A4(ANX2，膜联蛋白2)]；⑤分子伴侣[60ku heat shock protein(HSP60，热休克蛋白60)，heat shock protein beta?1(热休克蛋白β?1)，prohibitin(PHB，抑制素)]；⑥转录及翻译相关蛋白[heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H(hnRNP H，不均一性核糖核蛋白H)]；⑦杂类[Rgr protein，nucleophosmin(NPM)，poly(rC)?binding protein 1(PCBP1)]。
图2 人肺腺癌细胞系A549细胞双向电泳图谱中1号蛋白质点的肽质量指纹图谱（略）
Fig.2 Peptide mass fingerprinting of protein spot No. 1 in 2?DE profile from human lung adenocarcinoma cell line A549 cell
表1 人腺癌细胞系A549细胞双向电泳凝胶部分蛋白质点鉴定结果（略）
Table 1 List of identified protein spots in 2?DE gel from human lung adenocarcinoma cell line A 549 cell
3 讨论
蛋白质组学技术已成为当前探讨肿瘤发病机制的最有效的策略之一。由于样品制备相对容易及在膜蛋白、信号转导通路及分泌蛋白等的研究中具有较大的优势，故肿瘤细胞系是肿瘤蛋白质组学研究的良好模型[4?5]。A549细胞是从肺癌患者癌组织中分离出来的非小细胞肺癌细胞系，与患者体内的癌细胞具有基本相似的生物学特性。为了在蛋白质组水平探讨肺腺癌发生的分子机制，本文应用2?DE/MALDI?TOF?MS方法对人肺腺癌细胞系A549细胞进行了表达蛋白质组学研究。经2?DE分离、图像扫描及分析后，发现3块胶的平均蛋白斑点数为1138±49，用其中1块胶作为胶进行匹配，平均匹配点数为986±32，匹配率为85.8%。提示我们获得了重复性较好的A549细胞的2?DE图谱。从3块胶上匹配的蛋白点中随机选取背景清晰、边界清楚、蛋白含量较高的20个斑点进行质谱分析，初步鉴定了15种蛋白质。根据功能，这些蛋白质可分为基本代谢相关的酶类、细胞骨架蛋白、应激相关蛋白、分子伴侣、信号转导分子、转录及翻译相关蛋白及其他等。
果糖2?磷酸醛缩酶A为糖酵解相关的酶类。Li等[6]应用2?DE?MS研究了20例人肺鳞癌及其配对的正常肺组织后发现，包括果糖2?磷酸醛缩酶A在内的6种蛋白质在癌组织中表达上调，提示这些蛋白可能对肺鳞癌早期诊断和靶向具有重要意义。RALDH是与维甲酸(retinoic acid, RA)合成有关的关键酶。研究表明，氮能通过抑制RALDH而干扰维甲酸信号通路，导致先天性膈疝和肺发育不良[7]。
细胞骨架(cytoskeleton)具有决定和维持细胞形态、对细胞器和细胞浆中的蛋白质进行空间组织及参与细胞运动、分裂、胞浆运输等功能，是抗癌药物作用靶点之一。CK8是细胞骨架的重要成分，是上皮细胞与肿瘤细胞相关的21种中间丝家族表达最广泛的成员。在Fas受体介导的信号途径中，CK8是JNK(c?jun N?terminal kinase)的胞内靶点。已知紫杉醇的抗癌作用主要与其可和β?链微管蛋白结合有关。应用反义寡核苷酸技术，Tommasi等发现抑制β?链微管蛋白可部分提高紫杉醇的化疗敏感性。Mozzetti等[8]发现，在耐药的卵巢癌细胞中，β?链微管蛋白表达明显上调，推测该蛋白过表达可能是泰索帝三种耐药机制中最重要的一种。
PDI为应激相关蛋白，可催化蛋白质肽链内及肽链间二硫键的连接及蛋白折叠，调节转录因子的活性，参与糖蛋白的组装等。Bianchi等[9]认为，PDI通过细胞应激和蛋白折叠而参与肿瘤形成。Ryu等对人胃癌组织及其配对的正常胃组织、癌旁组织进行了蛋白质组学研究，结果显示，包括PDIA3在内的7种蛋白在癌组织中表达上调，提示癌细胞具有自我保护机制。为了寻找胃癌早期诊断标志蛋白，Ren等[10]应用SELDI?TOF?MS技术检测了胃癌患者及正常人的血清，筛选出了一个包括PDIA3在内的四种蛋白质组成的标志物组合模式。
分子伴侣能抑制细胞内蛋白降解，帮助蛋白正确折叠，能调节蛋白分泌、细胞运动、基因表达，还参与细胞周期、细胞凋亡和分化等的调控。研究发现，HSPβ?1及HSP60等可能与癌细胞对化疗、放疗抵抗有关。另外，近年发现，HSP可能与黏液分泌有关[11]，而部分肺泡细胞癌(腺癌的一个亚型)临床表现为大量水样痰液，两者之间是否有关值得进一步研究。PHB属于肿瘤抑制蛋白。关于PHB与临床疾病的关系报道甚少。我们以前的研究显示，PHB在小细胞肺癌组织中表达明显强于正常肺组织[12]。出现这种矛盾的结果可能与PHB的磷酸化状态、细胞内浓度、细胞类型、肿瘤分期及肿瘤细胞的代谢旺盛程度有关。
膜联蛋白属于钙依赖性磷脂结合蛋白家族。ANX1具有调控肿瘤细胞生长、增殖，调节细胞骨架的胞内信号传导、抑制凋亡等功能。Brichory等[13] 应用血清学蛋白质组分析(SERPA)发现肺腺癌及鳞癌患者血清中存在ANX 1及2糖基化抗体(腺癌60%，鳞癌33%)，而非癌对照者血清中未检测到ANX 1及2抗体，提示ANX1和2及其抗体可能有助于肺癌的诊断。Dai等[14]应用高通量糖组学(glycomic)方法，比较高、低转移潜能肝癌细胞系糖蛋白表达谱，发现ANX1、CK8等的表达水平及其它们的聚糖部分的变化可能与癌细胞的转移潜能有关。
hnRNP是一类RNA结合蛋白，与RNA的拼接、端粒酶DNA序列的调节、细胞周期调控、mRNA由胞核到胞质的转运及细胞分裂、分化、凋亡等密切相关。Rauch等[15]发现，和正常组织相比，hnRNP H等三种蛋白在原发及转移性头颈部癌组织中表达明显上调，提示该蛋白有望成为肿瘤标志物。
NPM是一种重要的核磷酸蛋白，能调节细胞生长和分化，诱导有丝分裂原形成，参与核糖体RNA的加工、细胞周期调控、中心体的复制及维护基因组的稳定。近年发现[16]，该蛋白与肿瘤的形成密切相关。PCBP1为RNA结合蛋白，具有转录调节活性和RNA分子伴侣功能。已知许多真核细胞mRNA的翻译是由核糖体进入位点(internal ribosomal entry sites, IRESs)介导的；原癌基因C?myc的5?未翻译区域含有一个IRESs，PCBP1能激活IRESs[17]。关于PCBP1与肿瘤关系的研究目前尚未见报道。Rgr(RalGDS?related)属于癌基因，其人类形式最近被鉴定，并已在人T细胞淋巴瘤中进行了检测[18]。
综上所述，应用2?DE/MALDI?MS方法对人肺腺癌细胞系A549细胞进行了表达蛋白质组学研究，获得了较为理想的2?DE蛋白质表达谱，初步鉴定了15种蛋白质，其中关于RALDH1、PCBP1及Rgr与肿瘤关系的研究报道鲜见。
基金项目：国家基金资助项目(No. 30570795)和陕西省自然科学基金资助项目(No. 2005C253)
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