流动注射化学发光法测定氢化可的松
作者：熊迅宇，唐玉海，王楠楠，武世界
【摘要】 目的 确定以高锰酸钾?亚硫酸钠体系测定氢化可的松的流动注射?化学发光分析方法。方法 在酸性条件下，氢化可的松对高锰酸钾?亚硫酸钠体系发光反应具有明显的增敏作用。据此，建立了流动注射化学发光测定氢化可的松的分析方法。结果 在优化的实验条件下，氢化可的松质量浓度在1.0×10-9-1.0×10-6g/mL范围内与发光强度呈良好的线性关系，检出限(3R)为4.0×10-10g/mL，对氢化可的松进行11次平行测定，其相对标准偏差为2.2%。结论 本方法应用于注射液中氢化可的松含量的测定，快速、准确、简便，灵敏度高、线性范围宽。
【关键词】 流动注射；化学发光；氢化可的松
Determination of hydrocortisone by flow?injection chemiluminescence
ABSTRACT: Objective To establish a new flow?injection chemiluminescence(CL) method for the determination of hydrocortisone. Methods In H2SO4 solution, hydrocortisone could obviously enhance the chemiluminescence intensity of the reaction of KMnO4?Na2SO3 system. Based on this, a new flow?injection CL method for the determination of hydrocortisone was developed. Results There was a good linear relationship between CL intensity and the concentration of hydrocortisone in the range of 1.0×10-9-1.0×10-6g/mL. The detection limit was 4.0×10-10g/mL at a signal?to?noise ratio of 3∶1. The RSD of 11 assays was 2.2%. Conclusion This method can be successfully used to determine the quantity of hydrocortisone in injection. It is rapid, accurate, simple, and has high sensitivity and wide linear range.
KEY WORDS: flow injection; chemiluminescence; hydrocortisone
氢化可的松(hydrocortisone, Hd)，又名可的索、皮质醇，是肾上腺分泌的糖皮质激素的一种，其药理作用主要有抗炎、抗过敏和免疫抑制、抗核分裂等。临床上主要用于肾上腺功能不全所引起的疾病、类风湿性关节炎、过敏性皮炎、角膜炎、神经性皮炎、结核性脑膜炎等。目前，测定氢化可的松的方法主要有高效液相色谱法[1?6]、分光光度法[7?12]、旋光法[13?14]、光谱法[15?16]。但这些方法存在灵敏度低和操作繁琐等不足。化学发光分析法由于灵敏度高、分析速度快、方法简便等特点，越来越受到人们的青睐[17?19]。范顺利等[20]采用铁氰化钾?奎宁发光体系测定氢化可的松，但其灵敏度较低，方法的线性范围和检出限分别为5.0×10-8-5.0×10-5g/mL和2.0×10-8g/mL。本试验发现，在酸性介质中，氢化可的松对高锰酸钾?亚硫酸钠体系有明显的增敏作用。据此，建立了氢化可的松的流动注射化学发光新方法。
1 材料与方法
1.1 材料 IFFL?DD 流动注射化学发光分析仪系西安瑞迈科技有限公司产品。氢化可的松对照品溶液：精密称取氢化可的松对照品(药品生物制品检验所提供)0.0100g，用少量乙醇溶解后，用蒸馏水定容于100mL容量瓶中，即得1.0×10-4g/mL储备液，低温避光保存，使用时逐级稀释至所需浓度。亚硫酸钠溶液(5.0×10-2mol/L)：准确称取亚硫酸钠1.5755g，用蒸馏水溶解并定容于250mL容量瓶中，得5.0×10-2mol/L溶液，新鲜配制。高锰酸钾溶液(1.0×10-2mol/L)：准确称取0.1580g KMnO4，用蒸馏水溶解并定容于100mL容量瓶中，得1.0×10-2mol/L储备液，使用时稀释。氢化可的松注射液为山西晋新双鹤药业有限责任公司产品，标示量：10mg/支。试验所用试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。
1.2 方法 流动注射?化学发光仪器流路图见图1。流路a、b、c分别用来输送Na2SO3溶液、样品溶液、酸性KMnO4溶液。试验中，样品溶液和KMnO4溶液在三叉管M中混合，再与流路a中的Na2SO3溶液混合，发生化学发光反应，所产生的化学发光信号立即被光电倍增管检测，机记录的数据利用IFFL?DD型流动注射化学发光分析软件分析。按图1所示装置装好流路，开启蠕动泵，待基线稳定后进行测定，以相对发光强度ΔI进行定量。
图1 流动注射化学发光分析仪流路图（略）
Fig.1 Schematic diagram of the CL flow system for the determination of hydrocortisone
a: Na2SO3 solution; b: Sample solution; c: KMnO4?H2SO4 solution; M: Manifold; V: Six way values; P1, P2: Peristaltic pump; F: Flow cell; PMT: Multiplier phototube; HV: High voltage; COM: Computer; W: Waste solution
2 结果与讨论
本实验用1.0 × 10?6 g/mL氢化可的松对照品溶液进行条件优化。
2.1 仪器参数的优化 流路的选择：考察了不同流路对化学发光强度的影响。由于b、c管路无区别，所以只考虑a管路的情况。当a管路分别为 Na2SO3溶液、酸性KMnO4溶液和样品溶液，b、c管路为其他二者时，2.0×10-4mol/L KMnO4?1.0×10-2mol/L Na2SO3?1.0×10-6g/mL Hd中的相对发光强度分别为255、42、2。因此，当采用如图1所示流路时，氢化可的松的相对化学发光强度最大，且信号稳定。故本文选择此流路进行分析。流路参数的选择：蠕动泵转速、采样管长和阀池距都会影响反应混合液进入检测器的时间，从而影响检测器对发光信号的检测。本试验选择流通管内径为0.8mm。结果表明，当蠕动泵主泵转速为30r/min，副泵转速为35r/min，采样管长为10cm，阀池距为10cm时，测定具有最大的信噪比。
2.2 实验条件的优化 反应介质及其浓度的选择：分别考察了以HCl、HNO3、HAc、H2SO4、H3PO4和NaOH为反应介质的发光强度。在这些介质中，2.0×10-4 mol/L KMnO4?1.0×10-2mol/L Na2SO3?1.0×10-6g/mL氢化可的松的相对发光强度分别为2、8、15、136、109和1。H2SO4介质中化学发光信号最大，且信号稳定。因此，该实验选择H2SO4为反应介质。试验观察到，当H2SO4存在于Na2SO3中时，其浓度对发光无影响。所以选择将H2SO4加入KMnO4中，对H2SO4在0.01-0.5mol/L浓度范围进行了考察。试验表明，化学发光信号随着H2SO4浓度的增加而增加，当H2SO4浓度超过0.1mol/L时，发光信号随H2SO4浓度变化很小。考虑到发光信号的稳定性及H2SO4对管路的腐蚀性，我们选择0.1mol/L的H2SO4为最佳浓度。氧化剂的选择：试验对高锰酸钾、高碘酸钾、高氯酸钾、重铬酸钾等氧化剂做了考察，观察到在KMnO4中化学发光信号最大，而在其他氧化剂中几乎无化学发光。因此，试验选择KMnO4作为氧化剂。考察了KMnO4在1.0×10-4-8.0×10-4mol/L浓度内对发光信号的影响。试验表明，随着KMnO4浓度的不断增加，相对化学发光强度也不断增大；当浓度增加到2.0×10-4 mol/L时，相对化学发光强度出现最大值；当浓度大于这一数值时，由于KMnO4本身颜色加深，产生内滤效应使化学发光强度降低。因而，实验中所选的KMnO4浓度为2.0×10-4mol/L。Na2SO3浓度的选择：考察了5.0×10-3-0.1mol/L范围内不同浓度Na2SO3对化学发光强度的影响。结果表明，随着Na2SO3浓度的不断增加，相对化学发光强度也不断增大，当Na2SO3浓度超过1.0×10-2mol/L时，相对发光强度随浓度的增大变化不大。因此，试验中选择1.0×10-2mol/L作为Na2SO3的最佳浓度。
2.3 标准曲线、精密度及检出限 在优化的最佳实验条件下按图1所示装置装好流路，对氢化可的松的对照品溶液进行逐级稀释并测定分析，以相对发光强度ΔI(即样品的化学发光强度减去空白的强度)对浓度做图。结果表明，在1.0×10-9g/mL-1.0×10-6g/mL范围内发光强度与药物浓度呈良好的线性关系。对浓度为1.0×10-6g/mL的氢化可的松进行11次平行测定，其相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)为2.2%。计算得氢化可的松的检出限为4.0×10-10g/mL。为了提高检测的精密度，标准曲线分段绘制，其相关线性参数见表1。
表1 氢化可的松的标准曲线及其参数（略）
Table 1 Parameters for calibration curve and detection limit of hydrocortisone（略）
ΔI: relative CL intensity; C (concentration): ng/mL
2.4 干扰实验 在1.0×10-6g/mL的氢化可的松对照品溶液中，对实验中可能存在的辅料以及干扰物质进行分析。结果表明在相对误差为±5%条件下，1000倍的K+、Ca2+、Cl-、NO-3；200倍的Mg2+、Zn2+、CO2-3；100倍的抗坏血酸、EDTA；10倍的葡萄糖、乳糖、蔗糖不干扰测定。
2.5 样品分析 取氢化可的松注射液10支，精密量取相当于50mg的氢化可的松，用蒸馏水定容于50mL容量瓶中，配成1.0×10-3g/mL的待测溶液。精密吸取上述溶液适量，加水稀释至工作曲线线性范围内，按图1所示流路进行测定，并采用标准加入法进行回收率试验，测定结果见表2。同时与药典[21]方法做对比，测定结果见表3。
表2 氢化可的松的回收率试验（略）
Table 2 Determination results of recovery test
表3 氢化可的松注射液中氢化可的松含量的测定（略）
Table 3 Determination results of hydrocortisone in pharmaceutical injections
2.6 发光机理探讨 氢化可的松对KMnO4?Na2SO3发光反应具有增敏作用，[22]和实验资料，我们认为该体系化学发光反应的实质是在酸性条件下氢化可的松首先受到高锰酸钾的氧化生成大量活泼的单线态氧1O2(1Δg)，1O2(1Δg)再迅速与Na2SO3反应生成S2O2-6，S2O2-6随后分解为SO*2，SO*2回到基态的SO2时产生强烈的化学发光。由此可以推断，高锰酸钾?亚硫酸钠?氢化可的松体系的发光体可能为激发态的二氧化硫，整个机理可以表示为：MnO-4+Hd+H+→ 1O2(1Δg)+Mn(Ⅱ-Ⅳ)+产物1O2(1Δg) + Na2SO3→ S2O2-6S2O2-6 → SO2-4+ SO*2SO*2 → SO2+ hν
【】
[1]Yuko RN, Per OE. Determination of corticosteroids in tissue samples by liquid chromatography?tandem mass spectrometry [J]. J Pharm Biomed Anal, 2005, 37(2):341?350.
[2]Hájková R, Solich P, Dvorák J, et al. Simultaneous determination of methylparaben, ropylparaben, hydrocortisone acetate and its degradation products in a topical cream by RP?HPLC [J]. J Pharm Biomed Anal, 2003, 32(5):921?927.
[3]Grippa E, Santini L, Castellano G, et al. Simultaneous determination of hydrocortisone, dexamethasone, indomethacin, phenylbutazone and oxyphenbutazone in equine serum by high performance liquid chromatography [J]. J Chromatogr B, 2000, 738(1):17?25.
[4]张顺国，陈敏玲，唐跃年. 高效液相色谱法测定尿中氢化可的松和6β?羟基氢化可的松的含量 [J]. 药学杂志, 2004, 24(12):733?735.
[5]单萍萍，申国庆. 高效液相色谱法测定复方联苯苄唑搽剂中联苯苄唑和氢化可的松的含量 [J]. 江苏药学与临床研究, 2006, 14(1):26?28.
[6]杜静, 傅应华. 离子对反相高效液相色谱法同时测定复方氟脲嘧啶二甲亚砜溶液中氟脲嘧啶和氢化可的松的含量 [J]. 中国应用药学杂志, 2005, 22(2):163?165.
[7]Lemus Gallego JM, Pérez Arroyo J. Spectrophotometric determination of hydrocortisone, nystatin and oxytetracycline in synthetic and pharmaceutical preparations based on various univariate and multivariate methods [J]. Anal Chim Acta, 2002, 460(1):85?97.
[8]李小军, 王永桂. 分光光度法测定氯霉素氢化可的松滴耳液中氢化可的松的含量 [J]. 中国药事, 2004, 18(3):179?180.
[9]刘菁. 双波长分光光度法测定氯可滴耳液中氢化可的松含量 [J]. 中国药师, 2001, 4(4):306?307.
[10]高新富，王玉，张循格，等. 三波长分光光度法测定氢化可得松软膏的含量[J]. 药品检测, 1999, 8(7):48?49.
[11]林宇星，郑璇. 卡尔曼滤波分光光度法测定口康含漱液中3组分的含量 [J]. 海峡药学, 2000, 12(4):38?40.
[12]姜明燕，沈君，张家林，等. 紫外分光光度法测定复方马来酸氯苯那敏酊中两组分含量 [J]. 中国药学杂志, 1997, 32(7):426?427.
[13]胡道德，辛维兰. 旋光法测定复氢霜中氢化可的松的含量 [J]. 华西药学杂志, 1998, 13(3):196?197.
[14]张赛男. 旋光法测定氢化可的松二甲基亚砜溶液中氢化可的松 [J]. 海峡药学, 1997, 9(3):53?54.
[15]张艳，茅志安，汪建民，等. 褶合光谱法测定复方氧氟沙星滴耳液含量 [J]. 药学实践杂志, 1999, 17(1):40?42.
[16]刘世军，杨樊辉，张建成，等. 褶合光谱法测定氢化可的松麻黄碱滴鼻液中氢化可的松和盐酸麻黄碱的含量 [J]. 武警医学, 2004, 15(6):419?421.
[17]饶志明，吴秋莲，谢国平，等. 流动注射化学发光测定盐酸普萘洛尔 [J]. 分析化学, 2004, 32(12):1660?1662.
[18]范顺利，吴志皓，张磊，等. 多巴酚丁胺的流动注射化学发光法测定 [J]. 分析测试学报, 2003, 22(2):87?89.
[19]韩小年，唐玉海，于春玲，等. 流动注射化学发光法测定吩噻嗪类药物 [J]. 西安大学学报(医学版), 2005, 26(6):611?613.
[20]范顺利，李薇，林金明，等. 反相流动注射?化学发光法测定氢化可的松 [J]. 分析化学, 2004, 32(11):1421?1425.
[21]国家药典委员会编. 中华人民共和国药典(二部) [M]. 北京: 化学出版社, 2005:404.
[22]张志洁, 壮亚峰, 鞠熀先. 阿西美辛在高锰酸钾?亚硫酸钠体系中的流动注射化学发光分析 [J]. 药学学报, 2004, 39(11):925?928.
