男性不育机制部分研究热点的探讨
【摘要】 半个世纪以来，男性不育患者的比例有升高趋势，但其病因和发病机制仍未完全阐明。本文结合我们的部分研究成果，概括介绍男性不育机制的部分研究热点，着重介绍精索静脉曲张、甲醛及男性不育相关基因与男性不育的可能关系。
【关键词】 男性不育；精索静脉曲张；环境；甲醛；不育相关基因
Approach on the some hot spots of male infertility pathogenesis
ABSTRACT: In recent half century, the incidence of male infertility is in an increasing tendency; however, the etiological factors and its pathogenesis are not fully clarified yet. By associating with the some results of our research, some hot spots on the pathogenesis of male infertility are briefly approached here, and the effects of varicocele, formaldehyde and infertility?related genes on male infertility are especially focused.
KER WORDS: male infertility; variccocele; environment; formaldehyde; infertility?related gene
世界卫生组织(World Health Organization, WHO)对男性不育的定义是：夫妇同居一年以上，未用任何避孕措施，由于男方因素造成的女方不孕。据报道，世界范围内约有15%-20%的育龄夫妇不能生育[1]，且近半个世纪以来，由于环境、心理、社会等因素的影响，男性精子的数量和质量出现了明显下降的趋势[2?3]，男女不育的比例也已由3∶7上升到5∶5[3]，男性生殖健康正受到严重威胁。
1994年在开罗召开的国际人口与大会上提出“2015年人人享有生殖健康”的宏伟目标；WHO部署的21世纪生殖生物学研究的重点之一是雄性生殖生物学，男性不育是其中的一项重要内容。分子生物学、分子遗传学和辅助生殖技术的发展，为男性不育机制的研究提供了新的研究思路和手段，并正取得令人可喜的进展。
1 男性不育的病因和发病机制
男性生殖参与了包括精子发生、成熟和排放，精子在女性生殖管道内的获能，精子与卵子结合发生受精等一系列复杂的生理过程。男性生殖功能除了受到经典的下丘脑?垂体?性腺轴调节以外，还受到诸如生长因子(growth factor)、抑制素(inhibin)、激活素(activin)、白细胞介素?1(interleukin?1, IL?1)、维生素A(Vitamin A, VA)等众多生物活性因子的调控；现有研究表明，其基因水平的调控也十分复杂，原癌基因、无精症相关基因、减数分裂基因、DNA复制相关基因、细胞周期蛋白基因、调节核蛋白转型基因以及温度相关基因等均参与了精子发生和成熟的调控过程；近年来一批附睾特异基因相继被德国和美国家以及我国的张永莲院士等所克隆，并逐步应用于精子附睾内成熟机制的研究，如GPX5、AEG、CRES、Bin2a、Bin1b和SC等[4?5]。上述调控因素中任一环节的失调或受到致病因素的干扰均可能影响男性生殖过程，因而使男性不育的病因和发病机制变得纷繁复杂。目前，精索静脉曲张(varicocele, VC)引起的不育，环境及理化因素的影响，如高温、电磁辐射、环境雌激素、重金属、甲醛等所致的不育，内分泌性不育，免疫性不育，感染性不育以及特发性男性不育等尤其受到男科学研究者们的关注。现就其中几个近年研究的热点以及本中心在这几方面研究的部分成果做一介绍。
1.1 精索静脉曲张与男性不育的关系 精索静脉曲张已经成为男性不育症的重要原因，占男子不育症发病率的首位[6]。精索静脉曲张并发不育的发病率占男性不育的15%-40%，伴精液异常者占54.8%，主要表现为精子发生阻滞，精子数量减少，精子质量下降。在原发性男性不育患者中，VC的发病率约为35%，在继发性不育患者中可达80%，且无种族差异。
VC与男性不育密切相关，其不育形成属于后天获得且有明显的累进性特点，但迄今为止VC致不育的机理仍不十分清楚。目前的研究主要集中在VC对睾丸的影响上，如睾丸血流动力学和血管活性物质的毒性、氧化应激及生殖细胞凋亡等。Sakamoto等 [7]利用彩色多普勒超声研究发现，与VC相关的不育者中，返向血流的存在是导致男性不育的重要原因，返向血流引起的代谢产物返流使得肾上腺、肾脏的代谢产物如儿茶酚胺类物质、前列腺素、皮质醇以及毒性代谢产物5?羟色胺等逆流进入睾丸而影响生精过程并杀伤精子，显著影响精子的活动力。Agarwal等 [8]和分析了23份关于氧化应激在VC不育中的作用的研究资料，发现VC不育男性血液中活性氧的浓度显著增高，同时抗氧化能力显著下降。因此，氧化应激在VC不育中被认为起着重要作用。提高患者睾丸组织的抗氧化能力可以预防VC不育的发生[9]。此外，VC时局部高温及血液中毒性物质增加也会诱发生殖细胞凋亡的增加而导致不育。Ku等[10]研究表明凋亡在VC所致生殖细胞病理改变和生精功能障碍中起着重要作用。
VC对附睾影响所致男性不育的机制研究目前还没有得到足够重视。因而相对滞后。本中心张秋养等[11?12]在成功建立大鼠实验性左侧精索静脉曲张(experimental left varicocele, ELV)模型的基础上，用形态学、机能学和分子生物学等技术，比较全面系统地研究了ELV对附睾结构和功能的影响，取得了一些可喜的成果。研究表明：ELV不仅可以造成模型鼠睾丸的病理改变，而且同样可以引起附睾的显微和超微结构的明显病理损伤；造成附睾内的蛋白成分、α糖苷酶活性和肉毒碱含量的明显改变。说明VC所致不育不仅与睾丸的结构功能异常有关，也可能与附睾结构和功能的病理性改变密切相关。
为了深入探讨附睾在VC所致男性不育中的地位，本课题组又在核酸和蛋白水平上对一些附睾基因和附睾特异基因在正常大鼠和ELV大鼠附睾中的表达进行了时空变化的研究[13?17]，即既研究了目的基因在正常大鼠发育各阶段的表达变化，又研究了它们在附睾各区段的表达差异，并与ELV后附睾中的相应表达水平进行了详细比较。我们已经发表和尚未发表的结果表明：
①血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其受体VEGFR1和VEGFR2、Bin2a、生殖细胞核因子(germ cell nuclear factor, GCNF)、精子结合抗原11(sperm associated antigen 11, SAPG11)以及胱蛋白酶抑制剂相关的附睾精子发生因子(cystatin?related epididymal spermatogenic, CRES)等的mRNA和蛋白在大鼠附睾中均有不同程度的表达，且它们在附睾内的表达具有年龄变化特点和附睾区段和上皮细胞分布的特异性；在ELV模型大鼠附睾中，它们的表达均呈现不同程度的异常。
②VEGF及其受体VEGFR1和VEGFR2共表达于附睾管上皮主细胞，VEGF又高表达于上皮亮细胞。说明VEGF及其受体不仅是调节血管生长的活性因子，而且可能直接与附睾管上皮细胞的功能活动及管腔内精子的成熟过程有关。并首次证明ELV可影响大鼠附睾内VEGF及其受体的表达，其表达在ELV 4周时上调、8周时下调。说明VEGF及其受体的表达与ELV密切相关[13]。
③Bin2a mRNA在大鼠附睾头部有特异性表达，且特异表达于附睾上皮主细胞，它可能直接参与主细胞的功能活动并与附睾精子成熟有关。首次证明该蛋白在ELV大鼠附睾中表达下调，其下调程度随ELV时间的延长而加重。
④GCNF出现于14d龄(附睾上皮开始分化的时期)后的大鼠附睾上皮细胞核内，说明它可能与附睾上皮的分化和发育有关[14]。它可能参与那些与上皮分化和发育有关的附睾基因的表达调控过程。并证明GCNF蛋白在ELV大鼠附睾中表达下调，其下调程度随ELV时间延长而加重。
⑤SPAG11C和E是SPAG11蛋白的两个异构体，在附睾中，SAPG11主要定位于附睾管上皮主细胞的胞浆内，主细胞的静纤毛也有弱表达，而亮细胞、晕细胞及基细胞均未见阳性染色。其中SPAG11E表达水平以附睾体部近、中段及尾部较强，而SPAG11C在附睾体部近端最强，体部中段至尾部表达逐渐减弱甚至消失；但两者在附睾始段均未见阳性表达[15?16]。此外，它们也定位于睾丸生精上皮的圆形和长形精子细胞的顶体泡和顶体中，尤以第6-10级、第17-19级精子细胞中表达最强，而间质细胞、支持细胞、各级生精细胞以及残余体均呈阴性染色。由此说明，它们可能既参与了精子的发生，也参与了精子的成熟过程。并首次证明ELV 2周和4周后，附睾组织中SPAG11基因和蛋白的表达均显著下降，尤以4周组为甚；而其蛋白在睾丸中的表达在ELV 2周时增加，4周时下降，提示其可能与VC所致的不育有某种联系。
⑥CRES表达于整个附睾上皮主细胞的胞浆中，附睾头部管腔的分泌物也呈阳性，而晕细胞、亮细胞、基细胞染色为阴性。由此说明，它是附睾分泌蛋白，可能参与精子的成熟过程。此外，CRES也定位于睾丸圆形精子细胞和长型精子细胞的胞浆、顶体以及生精上皮的残余体中，其中在Ⅸ-Ⅲ期的长型精子细胞中表达最强，在Ⅳ-Ⅵ期开始减弱，而在其他的生精细胞以及支持细胞和间质细胞中均呈阴性染色。免疫组化和蛋白印迹还表明，ELV 2周和4周后，睾丸及附睾内的CRES表达与对照组相比均有增强[17]。
上述基因及其表达蛋白在正常大鼠附睾或睾丸中的表达，以及它们在ELV大鼠模型相应器官内表达水平表现出的不同程度或不同区段的上调或下调，不仅说明它们的表达与附睾的结构和功能有关，而且说明VC可以引起它们在核酸或蛋白水平的表达异常。这种分子水平的变化可能进而与VC所致的继发性不育之间产生某种联系，但其确切机制及途径尚未阐明，为此值得我们去做更深入的研究。
1.2 环境因素与男性不育的关系 随着现代的发展，大量化学物质释放到界中对人类居住环境造成极大的污染。环境因素，特别是环境雌激素和甲醛等有害因子与男性不育的关系因此也越来越受到研究者的重视。
环境雌激素：外源性化学物质通过与人体雌激素受体结合或通过影响细胞信号途径等方式，产生模仿或部分模仿雌激素的生理作用，这类物质被称为环境雌激素。迄今为止，已发现有70余种人工合成的化学物质显示出不同程度的雌激素活性。按性质可以分为三类：①人工合成的雌激素，包括己烯雌酚、炔雌醇、炔雌醚等；②工业化学污染物，如烷基酚类、有机氯农药、邻苯二甲酸类；③生物来源的雌激素，主要来自植物和真菌，如异黄酮类。研究表明这些物质不仅可致睾丸萎缩，精子减少，甚至可引起小儿隐睾、尿道下裂、附睾囊肿和睾丸癌等病变，因而与男性不育密切相关。
环境雌激素对生殖系统的毒性作用机制复杂，目前较公认的作用途径是环境雌激素干扰性激素的合成、代谢和运输[18]，即环境雌激素进入细胞后首先与雌激素受体(estrogen receptor, ER)相结合，通过ER介导而产生相应的生物学效应，从而影响动物及人类的生殖能力。除ER外，其他受体如雄激素受体，甲状腺素受体等都可和环境雌激素结合而影响内分泌功能。除受体模式外，某些环境雌激素如DDT，林丹等可干扰毒物代谢酶CYP1A1mRNA的表达[19]，从而干扰内源性激素的代谢，间接干扰内分泌功能。另外，植物雌激素大豆异黄酮可通过抑制拓扑异构酶而使细胞有丝分裂停滞并导致染色体畸变[19]。双酚A可引起支持细胞凋亡，干扰和减弱支持细胞对生精细胞的支持和营养作用，从而影响精子发生和发育[20]。总之，由于环境雌激素种类繁多，其生殖毒性作用机理也多样化。
甲醛：调查显示，城市居民每天在室内工作、生活和学习的时间长达21.53h，占全天时间的92%[21]，人类社会已进入以“室内空气污染”为特点的第3次污染时期[19]。室内空气污染的主角是甲醛。甲醛在室内主要来源于建筑材料、家具、各种粘合剂涂料、墙壁装饰材料、合成织品(如地毯、装饰品)及化妆品、清洁剂、杀虫剂、防腐剂以及煤炉、液化气的燃烧、藏书的释放等。室外空气中的甲醛主要来自石油、煤、天然气等燃料的燃烧，润滑油的氧化分解，汽车尾气排放，大气光化学反应，以及生产甲醛、尿醛树脂、化学纤维、染料、橡胶制品、塑料、墨水、喷漆、涂料的工厂等地。此外，研究表明，甲醛的释放是一个持续过程，释放时间可持续3-15年[22]。中华人民共和国国家标准中《居室空气中甲醛的卫生标准》规定，甲醛应小于或等于0.08mg/m3。但是，我国目前新装修和装修过的场所(居室、办公室、商场等)普遍存在甲醛含量超标的现象。
Mcgregor等[23]研究发现甲醛的前体吸入可诱导雄性大鼠间质细胞腺瘤的发生。Karimov等[24]在雄性大鼠低剂量吸入甲醛混合气体一个月后发现，混合气体可引起部分大鼠精原细胞数量减少，生精上皮结构紊乱，生精周期破坏等现象。Oguz等[25]研究发现甲醛吸入可引起雄性Wistar大鼠生长迟缓，睾丸组织微量元素铜、锌含量下降。因为铜、锌是睾丸组织抗氧化酶的重要辅基，所以铜、锌含量的下降可使睾丸组织抗氧化能力下降，进一步诱导睾丸组织氧化损伤而引起不育。
我们从以下几个方面深入研究了甲醛的生殖毒性[26?27]：①对精子的影响，经过不同途径(经腹腔注射、呼吸道吸入)对雄性SD大鼠甲醛染毒后，精子的活动度及生存能力均减弱，精子计数也明显减少，精子的畸形率明显增加，并且精子的变化有一定的剂量依赖性。②对睾丸生殖细胞的影响，研究显示甲醛可以使生精周期紊乱，曲细精管数量减少，生精上皮变性和坏死。③从致毒机制研究方面，发现一定剂量甲醛的生殖毒性使大鼠睾丸发生脂质过氧化损伤，抗氧化酶减少，而过氧化物质增加，使睾丸的抗氧化能力降低，氧化损伤后引起DNA和蛋白质交联，而影响相关基因的正常表达。另外，甲醛染毒后引起睾丸生殖细胞凋亡率增加，以及影响支持细胞和间质细胞相关基因的正常表达等都可能参与了甲醛的致毒机制。
1.3 男性不育相关基因 研究显示，约有10%-15%男性不育是由染色体缺失和或基因突变引起的[28]。随着人类基因组测序的完成和功能基因组计划的开展，为研究男性不育的基因机制及它对睾丸、附睾功能的影响提供了条件。
1.3.1 性染色体与生精基因的缺失与突变[29?30] 研究发现的Y染色体上的AZF基因(azoospermia factor)、RBMY基因(RNA binding motif on the Y)、DAZ基因(deleted in azoospermia)和CDY1(chromodomain Y1)、BPY2(basic protein Y2)、PRY(PTABL related Y)和TTY2(testis transcript Y2)基因等可能与男性不育有关。X染色体上的雄激素受体(androgen receptor, AR)基因、泛素蛋白酶26(ubiquitin?specific protease 26, USP?26)基因突变也与男性不育有关。
近年的研究热点主要集中在AZF基因和X染色体上的相关基因。AZF基因定位于Yq11。这一区域的异常和大多数原发性无精子症的发生密切相关。1996年Vogt等将Y染色体长臂上主导精子形成的区域分为AZFa、AZFb、AZFc等三区，这三区染色体上的基因分别主导精子形成过程中的不同阶段，AZFa的基因主导精母细胞的增生，故AZF基因缺失者病理表现为唯支持细胞综合征。AZFb基因(DAZsY134)缺失，病理发现生殖细胞成熟停滞；AZFc区(DAZsY254)基因缺陷可造成无精子症，也可造成精子极度稀少症。后来又发现了AZFd区。
X染色体上的AR基因定位于Xq11-12，包含8个外显子。AR在男性精子细胞分化过程中起着关键性作用。目前的研究热点是1号外显子，其上有两个多态位点，分别为CAG和GGC重复序列。另一基因USP?26(泛素蛋白酶26)定位于Xq26.2，特异表达于睾丸组织。该基因的突变与男性特发性不育症密切相关[28?30]。
从本中心对特发性男性不育患者进行的X染色体上USP26基因多态性研究表明，22.0%(9/44)的受检者的USP26基因发生突变，其中8人(19.5%)是复合突变(420位插入ACA，512位G被A置换)，1人(2.4%)是1096位的T被A置换(图1、2)。同时，512位的G→A置换也见于20%(3/15)的正常对照组。上述三种变化均可导致编码氨基酸的改变。由此说明，USP26基因在男性生殖中可能具有重要作用，USP26 基因突变可能与中国男性特发性不育有关[31?32]。
1.3.2 常染色体基因的缺失与突变[28,31] 研究发现DAZL基因、SYCP3基因、tsMCAK(KIF)基因、CSTF2T基因、MTHFR(亚甲基四氢叶酸还原酶)基因、ER(雌激素受体)基因、CFTR基因和CATSPER2基因等可能都与男性不育有关。
DAZL(DAZLA)基因被认为是DAZ基因的祖先基因，定位于3号染色体2区4带。Lin等人的研究显示，DAZL基因的转录水平在一些男性中明显降低，如精子发生过少，精子成熟停滞，唯支持细胞综合征等，且实验证明DAZL基因对精子形成过程中的有丝分裂和减数分裂起着重要作用。
SYCP3基因定位于12号染色体上，包含9个外显子，长约10.8kb，编码DNA结合蛋白。Miyamoto等研究结果显示该基因特异表达于睾丸组织中，是精子发生的必需基因。
图1 特发性男性不育样本USP26基因聚丙烯酰胺凝胶电泳银染SSCP分析图（略）
Fig.1 SSCP analysis of USP26 gene in idiopathic infertility with silver stained polyacrylamide gel electrophoresis
Lanes 1-8 in fragment (A) and lane 9 in fragment (B) showing the SSCP variants. These abnormal bands suggest the possibility of gene mutation
图2 USP26基因测序的结果（略）
Fig.2 Sequencing results of USP26 gene
A: showing 363?364insACA→T121ins; B: showing 460G>A→V154I; C: showing 1044T>A→F348L compared to corresponding control samples respectively
tsMCAK(KIF)基因定位在1p34，含有20个外显子，它是基因HsMCAK的剪接变体，同时也是驱动关联蛋白(KPPs)的新成员。Cheng等研究证实tsMCAK基因可以干扰细胞的有丝分裂和减数分裂而影响精子发生。CSTF2T基因定位于10q22-23，长约2324bp，无内含子，编码的蛋白质包含616个氨基酸。Dass等研究结果显示，CSTF2T基因在睾丸组织中表达，且最有可能表达于生殖细胞。
MTHFR基因定位于1p36.3。有研究表明，MTHFR基因677位突变，C被T置换，编码的丙氨酸(Ala)被缬氨酸(Val)置换与特发性少精子症有关。
ER基因：雌激素通过雌激素受体发挥作用。雌激素受体包括ERα 和ERβ，编码基因分别定位于染色体6q25.1和14q22-24。ERα和ERβ可以形成异二聚体，激活磷脂酰肌醇?3激酶途径，共同控制精子存活。
CFTR基因定位于7q31。据报道，复合杂合子中CFTR基因P1290S错义突变与先天性输精管缺失症(CBAVD)和囊性纤维病(CF)密切相关。
CATSPER2基因定位于15q15。Avidan等人在克隆先天性红细胞生成不良性贫血基因时，从法国一家系中发现，3个兄弟除患有该病外，还合并弱畸形精子症及耳聋。
综上所述，男性不育症并非是一种独立的疾病，而是多种因素综合作用的结果，积极探讨男性不育症的病因，对防治男性不育，促进男性生殖健康将起到非常重要的作用。
2 展望
尽管对男性不育的研究已经有了大量的临床和实验基础的积累，但由于人类生殖的复杂性，人类对自身生殖的了解仍然非常有限，人类生殖还有很多未解之谜。相信随着分子生物学、分子遗传学和人类辅助生殖技术的，很多谜底都将被揭开，男性不育的机制和诊治终将会得到圆满的解决。
基金项目：国家基金资助项目(No.30371425, No.30471735)；部科学技术研究重点资助项目(No.105157)；陕西省科技攻关资助项目(No.2005K15?G2)
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