复方丹参方中使药冰片对君药丹参药代动力学的影响
作者：郑晓晖，赵欣，房敏峰，王世祥，卫引茂，郑建斌
【摘要】 目的 探讨复方丹参方中使药冰片对君药丹参在新西兰大白兔体内药代动力学过程的影响。方法 丹参组、丹参?冰片配伍组水煎液灌胃给药，液?液萃取法提取血浆中的丹参素，以对羟基苯甲酸为内标，采用离子阱质谱多级反应模式(MRM)测定兔血浆和脑脊液中丹参素的质量浓度，DAS数据处理软件药动学参数。结果 丹参?冰片配伍给药可使丹参中丹参素的药动学参数t1/2α、t1/2β、kα、AUC(0-∞)较单独给药时明显增大，丹参素的脑血比提高。结论 复方丹参方中，使药冰片可提高君药丹参中丹参素的生物利用度，减慢代谢，促进血脑屏障对丹参素的通透性。该研究可为“君–使”对药体内作用机制的研究提供思路。
【关键词】 丹参；冰片；药代动力学；“君?使”对药
方剂是中药新药研发的基础，其配伍理论及体内作用机制的研究是方剂关键问题的基础及要点,也是制约复方最佳化和中药化的瓶颈。复方丹参方是活血化瘀、芳香开窍、理气止痛的名方。其临床疗效[1]、体外药效学实验[2]、有效成分的含量测定[3]及药代动力学的研究[4?7]已有报道。王怡等对使药冰片在方剂中的作用进行了初步研究[8]，这对复方丹参方体内作用机制的研究具有积极作用。本研究选择复方丹参方中使药冰片和君药丹参为对象，采用高效液相色谱?离子阱质谱法(HPLC?MS?MS)研究君药丹参与使药冰片配伍前后，丹参中有效成分丹参素在兔体内的药代动力学变化，以探讨君?使对药的配伍机制，进而为中药引经理论的研究提供思路和方法。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
丹参、冰片药材(均购于陕西省药材公司，并经陕西省药品检验所鉴定)，丹参素钠对照品(药品生物制品检定所提供，批号：110855?200304)；内标对羟基苯甲酸(西安化学试剂厂)，甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)；实验用水为超纯蒸馏水(自制)；其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(包括在线脱气机、二元梯度泵，7725i手动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；Agilent 1100 SL型电喷雾?离子阱质谱；Anke TGL?16G型高速离心机；基因公司Maxima超纯水机；SartoriusBP221s型天平(美国Sartorius公司)；BF2000氮气吹干仪；SK?1型快速混匀器。
1.3 动物
新西兰大白兔36只，体重2.0-2.2kg，♀♂各半。由西安大学实验动物中心提供，动物合格证号：陕医动字第08?018号。
1.4 药材供试品溶液的制备
取丹参、冰片药材，粉碎，干燥至恒重。称取丹参150g ，以8倍量水浸泡30min，加热回流提取2次，每次1.5h，合并2次提取液，减压抽滤，浓缩至75mL，于4℃冰箱内保存。同法制备丹参(150g)?冰片(2.7g)合煎液。
1.5 实验设计
取新西兰大白兔18只，随机分为3组，每组6只，♀♂各半。丹参组丹参灌胃给药，剂量为10g/kg，配伍组丹参?冰片合煎液灌胃给药，丹参给药剂量为10g/kg，冰片给药剂量为0.18g/kg。对照组给予等剂量的丹参后立刻20g/L羧甲基纤维素灌胃。各组分别于给药后10、20、30、45、60、75、90、120、180、300、480、720min耳缘静脉取血1.0mL，测定血浆中丹参素的质量浓度。另取新西兰大白兔18只，随机分为3组，每组6只，♀♂各半。乌拉坦麻醉后，股动脉埋管以备取血；切开颈后部皮肤并分离肌肉以备从小脑延髓池抽取脑脊液，分组及给药方法同上，于给药后20、30、45、60、75min同时取血1.0mL和脑脊液0.3mL，测定血浆和脑脊液中丹参素的质量浓度，并计算脑血比。
1.6 分析方法
1.6.1 分析条件
色谱条件：色谱柱为Agilent TC?C18(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为甲醇?0.2%(体积分数)的甲酸水溶液(10∶90，V∶V)；检测波长为280nm；柱温为25℃；流速为0.8mL/min(柱后分流比3∶1)。质谱条件：电喷雾离子源；正离子检测；喷雾电压3.5kV；干燥气流速8.0L/min；干燥气温度350℃；雾化气压力40.0p.s.i；质量扫描范围50amu-1000amu。
1.6.2 生物样品供试品溶液的制备
取1.5项下待测生物样品(血浆1.0mL，脑脊液0.3mL)，8000r/min离心10min，取0.25mL上清液，加25μL 0.0021mg/mL对羟基苯甲酸，50μL 10%(体积分数)高氯酸沉淀蛋白，8000r/min离心10min，取上清液，用0.5mL乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，氮气吹干，残渣用0.5mL流动相溶解，0.45μm微孔有机滤膜滤过，10μL进样分析。
1.6.3 丹参素钠标准曲线的制备
取1.5项下对照组血浆或脑脊液0.25mL，加入 0.46mg/mL丹参素钠对照品溶液0.001、0.002、0.005、0.010、0.050、0.100、1.0mL，置于10mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，得质量浓度为0.0115、0.0230、0.0575、0.1150、0.575、1.150、11.50μg/mL的系列对照品溶液。按照1.6.2项下样品制备方法制备成对照品溶液，采用离子阱质谱的多级反应模式(MRM)进行分析，丹参素钠选择m/z 198.2为母离子，m/z 181.2为子离子，内标物对羟基苯甲酸选择m/z 139.3为母离子，m/z 93.1为子离子，分别计算m/z 181.2和m/z 93.1提取离子流图的峰面积。以两者峰面积的比值对丹参素钠的质量浓度进行线性回归，得方程为：Y=1.45X+3.61，γ=0.9999 (n=6)。结果表明：丹参素钠在0.0115-11.5μg/mL范围内具有良好的线性关系。
1.6.4 方法有效性验证
制备质量浓度分别为0.0230、0.1150、1.150μg/mL的丹参素钠血浆对照品溶液 (每种5份)，按1.6.1项下的分析条件进行测定，记录峰面积，以丹参素钠测得量与加入量之比相对回收率。精密度用日内和日间变异表示。以各浓度分别在同日测定5次的峰面积，计算日内变异。再按以上测定方法每日测定1次，连续5日重复测定，记录峰面积，计算日间变异。
1.7 数据处理
用SPSS11.0进行数据处理，实验结果以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，显著性检验水平设为α=0.05。药动学参数的计算用DAS 2.0 药动学程序自动处理。
2 结 果
2. 1 色谱行为及专属性
在上述分析条件下，对照组、丹参组和丹参?冰片配伍组血浆样品供试品溶液色谱图见图1-图3。由图可见，丹参素及内标在拟定色谱条件下均无内源性或外源性干扰，且与其他成分基线分离良好。
2.2 方法有效性验证
方法最低检测限为0.96ng/mL(S/N=3)。回收率和日内、日间变异符合生物样品分析指导原则[9]的要求，数据见表1。表1 方法有效性验证实验结果（略）
2.3 使药冰片对丹参素药代动力学的影响
所有数据均用DAS软件进行处理。图4为丹参组与配伍组丹参素的平均药?时曲线图。与丹参组相比，配伍组的曲线下面积明显增大。主要药代动力学参数见表2。与丹参组相比，配伍组药代动力学参数t1/2α, t1/2β, kα，AUC(0-∞)均有明显增大，经t检验分析，提示冰片与丹参配伍可影响丹参的吸收和代谢。配伍组t1/2Ka降低，提示冰片可加快丹参素在体内的吸收速率；分布容积V/F增加约2倍，提示冰片明显增加丹参素在体内与血浆蛋白等大分子的结合率。丹参素的脑血比测定结果见表3。经重复测量的方差分析表明，与丹参组相比，配伍组丹参素的脑血比在20、30、45、60、75min均显著性升高(P<0.05)；丹参组、配伍组组内各采样时间丹参素脑血比均无显著性差异，提示冰片提高血脑屏障对丹参素的通透性，增加丹参素在脑脊液中的分布。表2 丹参组与丹参?冰片配伍组丹参素兔体内药代动力学参数（略）表3 冰片对丹参素脑血比影响测定结果（略）
3 讨 论
以往报道，冰片可促进胃肠道对其他药物的吸收[8]。但在本研究中，冰片与丹参配伍给药时，丹参素血浆药物浓度上升较慢，t1/2α增大，提示冰片在胃肠道内可能干扰了丹参素的吸收速率；两组平均药?时曲线交点以后，配伍组的血浆药物浓度始终高于丹参组(图4)，AUC(0-∞)明显增加，说明冰片能提高其生物利用度。君药是复方的核心，在方剂中起决定性作用。使药的作用有两个方面，其一为引经，引导药力直达病所；其二为协调诸药，使复方药力成为一个有机整体。本研究选择复方丹参方中君药丹参和使药冰片为研究对象，以丹参的主要药效成分为指标，而将使药冰片作为一个整体，研究使药对君药药代动力学及组织分布的影响，旨在发现使药引药直达病所的体内机制，为中药引经理论及配伍理论的研究提供思路和方法。
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