过氧化物酶增殖体激活受体γ2转基因小鼠的制作及其影响因素分析
作者：赵四海，楚雍烈，郑华东，杨鹏辉，陈正兰，朱虹，范江霖，刘恩岐
【摘要】 目的 分析影响转基因小鼠制作的因素，优化转基因动物制作过程，建立适合本实验室的转基因小鼠制作方法。方法 利用显微注射方法制作转基因小鼠，对超数排卵的程序、受精卵的收集、外源基因的显微注射、胚胎移植和术后护理等影响因素都进行了对比研究。结果 优化了转基因小鼠的制作过程，减少了影响胚胎移植成功的不利因素，提高了过氧化物酶增殖体激活受体γ2(PPAR?γ2)转基因小鼠的制作效率(2.9%)。结论 成功制作了PPAR?γ2转基因小鼠，优化转基因小鼠的制作程序是提高转基因成功率的可行途径。
【关键词】 过氧化物酶增殖体激活受体γ2；转基因；小鼠；影响因素
转基因小鼠是生物医学研究中重要的动物模型[1?2]。1980年，Gordon等[3]首次利用显微注射方法成功制作转基因小鼠，开创了人类利用转基因动物模型的新纪元，此后各种转基因动物相继培育成功，在生物医学研究领域得到广泛的应用。到目前为止，Gordon等创立的将外源基因直接注射到受精卵雄原核中，进行胚胎移植，获得转基因动物的方法，仍然是目前制作转基因动物的主要方法之一。在本研究中，我们通过对过氧化物酶增殖体激活受体γ2(peroxisome proliferator?activated receptor γ2, PPAR?γ2)转基因小鼠模型制作过程的影响因素进行分析，探讨提高转基因效率的可行途径，建立适合本实验室的转基因小鼠的制作方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6J小鼠由西安大学医学院实验动物中心提供。所有实验用小鼠均在标准动物房饲养，温度控制在(22±3)℃，光控(12h明/12h暗)，自由采食，Co60灭菌饲料由第四军医大学实验动物中心提供。
1.2 试剂、药品和仪器
孕马血清(pregnant mare serum, PMS, 宁波激素厂)，人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG，宁波激素厂)，透明质酸酶(Sigma)，2×Taq PCR 试剂盒(北京天为时代)，蛋白酶K(Invitrogen)，M2和M16培养液(自制)。仪器：CO2培养箱(Shel lab)，P?97拉针仪(Sutter)，MF?900烧针仪(Narishige)体视显微镜(上海光学仪器厂)，显微注射系统(Eppendorf)，PCR 仪(ABI)，凝胶成像系统(Syngene)。
1.3 转基因小鼠的制作方法[4]
采用显微注射方法，其制作流程如图1所示。
1.3.1 目的基因的构建
构建ap2+PPAR?γ2(cDNA)目的基因，克隆、扩增、纯化后备注射。
1.3.2 超数排卵和同期发情
PMS和hCG诱发供体雌鼠(donor)同期发情和超数排卵。在实验第1天腹腔注射PMS(0.5u/只)，46-48h后给供体鼠注射hCG(0.5u/只)，hCG注射当天(实验第3天)下午和雄鼠合笼，次日早晨6∶30-8∶00检查雌鼠有无阴栓来判定是否已经交配成功，交配成功的雌鼠阴道口可见白色的阴道栓。
1.3.3 受体鼠(recipient)的准备
实验开始前应该提前准备输精管结扎雄鼠，挑选至少两次和雌鼠交配后都不能使其受孕的结扎雄鼠备用。实验第3天下午挑选数只雌鼠和结扎雄鼠合笼，次日晨6∶30-8∶00检查雌鼠阴栓来判定是否已经交配，交配成功的雌鼠用来作为胚胎移植的受体鼠。
1.3.4 受精卵的收集
处死供体鼠，打开腹腔，取出输卵管(保留一小段子宫)。将输卵管置于M2培养液中，用小镊子撕开输卵管膨大部，可见有受精卵团溢出，用吸管将受精卵团转移至含有透明质酸酶的M2培养液滴中，吹吸数次，洗掉泡沫细胞[5]。将受精卵转移至含有M16培养液滴的培养皿中，CO2培养箱内短暂培养。将受精卵转移至含有M16培养液滴的注射用平皿中，覆盖矿物油，准备显微注射。
1.3.5 显微注射
首先在倒置显微镜低倍镜下找到受精卵，然后转换至200倍下进行显微注射。寻找可以清晰看见两个原核的适合注射的受精卵(图2A)，用持卵针吸住一个卵，将注射针刺入受精卵雄性原核(因雄性原核较大，易注射)，加压将PPAR?γ2基因溶液注射到受精卵雄性原核，可见原核膨大(图2B)。注射后受精卵CO2培养箱内短暂培养。
1.3.6 胚胎移植
沿受体鼠背部中线，最后一根肋骨水平切1cm左右切口，找到输卵管。将DNA注射完毕后将外观形态良好的受精卵吸入移卵管，解剖镜下将受精卵移植到受体鼠输卵管壶腹部，缝合切口。
1.3.7 转基因小鼠的鉴定
约19-21d后受体鼠产下子代仔鼠。取大于3周龄仔鼠尾尖0.5-1cm提取DNA，PCR初步鉴定基因导入情况[6?7]，筛选出转基因阳性小鼠。
1.5 统计学处理
采用 SPSS11.5 统计软件进行分析。根据资料类型分别采用t检验和χ2检验，以P<0.05为差别有统计学意义(双侧)。
2 结 果
2.1 激素注射时间和收集受精卵时间对受精卵细胞的影响
为了探索适合本实验室条件的受精卵采集方法，我们设计三个不同实验，进行比较研究。第1组：第1天13∶00 腹腔注射PMS，第3天12∶00给hCG，第4天11∶00收集受精卵。第2组：第1天11∶00腹腔注射PMS，第3天10∶30给hCG，第4天13∶00收集受精卵。第3组：第1天11∶00腹腔注射PMS，第3天10∶30给hCG，第4天14∶30收集受精卵。其中第1组从104只供体鼠收集到1374枚卵细胞，平均每只收集13枚；第2组从102只供体鼠收集到1750枚卵细胞，平均每只收集17枚；第3组从172只供体鼠收集到2756枚卵细胞，平均每只收集16枚。经统计学分析，第2组和第3组收集的受精卵数显著多于第1组(P均<0.01)。通过改变激素注射时间和取卵时间可以获得更多的受精卵用于显微注射。
2.2 注射DNA溶液的量对受精卵的影响
外源DNA溶液注射过多容易引起受精卵溶解，过少制作效率低[4]。我们统计了12次原核不同DNA溶液注射量对受精卵存活影响的数据，第1组：原核稍微膨大(约膨胀30%-60%，根据受精卵原核大小，显微注射时肉眼估计)。第2组：原核显著膨大组(约膨胀60%以上)。数据显示第1组受精卵存活率明显高于第2组(表1)。表1 受精卵注射不同DNA溶液量后的成活率比较（略）
2.3 胚胎移植方法对实验结果的影响
传统的向输卵管移植胚胎要撕破囊膜(bursa)或剪开一个小口[4]。我们解剖胚胎移植失败的受体鼠发现，撕破囊膜进行胚胎移植手术容易出现因炎症引起的输卵管部位与腹壁的黏连，黏连发生率可达60%(9/15)，而通过囊膜穿刺移植胚胎组的黏连率只有20%(2/10)，黏连率显著低于前者(P<0.05)，这可能是导致胚胎移植失败的原因之一。通过囊膜穿刺移植胚胎的成功率约为38%(6/16)，大于撕破囊膜进行胚胎移植手术的成功率(25%，5/20)，但两种术式胚胎移植成功率没有显著统计学差异。
2.4 转基因效率
与实验程序优化前我们制作成功的SCD1转基因小鼠相比，改进转超数排卵、同期发情、胚胎移植等方法以后，PPAR?γ2转基因小鼠制作中基因整合率和转基因总效率等明显提高，各项指标如表2所示。小鼠出生后3周，剪取0.5-1cm尾尖，酚氯仿抽提法提取DNA做PCR检测，结果显示获得了转基因阳性小鼠(图3)。表2 转基因小鼠制作程序优化前后效率比较（略）
3 讨 论
转基因动物在生物医学研究中的应用越来越广泛[2,8?10]，但是转基因动物制作的成功率较低一直是该方法的瓶颈[6,8]。目前为止，显微注射法仍是制作转基因动物的最常用方法之一。显微注射方法的不足之处在于其转基因效率较低，目的基因向宿主动物基因组的插入是随机的，细胞核内的过程我们很难控制。Brinster等[11]人分析了注射DNA的类型、浓度和缓冲液成分等影响因素对外源DNA导入效率的影响。我们从优化转基因小鼠制作过程中的影响因素入手，探索提高显微注射方法的转基因效率。寻找适合自身实验条件的转基因动物制作程序是提高转基因效率的可行途径之一。我们的实验结果显示，激素注射时间和供体雌鼠取卵时间、原核DNA注射量、胚胎移植手术术式等因素均可影响整个转基因动物模型的制作过程。首先，调整激素注射时间和取卵时间可以获得更多的适合用于原核注射的受精卵；其次，原核DNA注射量是比较难以把握的，我们可以通过原核膨大的程度来粗略的衡量。实验过程中发现DNA注射量过大导致核内压力增大，当拔出显微注射针后可见部分DNA溶液(可能同时含有部分核内物质)因核内压力过大而溢出，原核萎缩，过多的注射量还促进了细胞的裂解。因此，控制合适的DNA注射量是十分重要的。我们认为显微注射后，原核比注射前膨大30%-60%是比较合适的。另外，胚胎移植是转基因动物制作过程中的重要技术之一，影响胚胎移植的因素有很多[12]。减少手术出血是手术成功的重要保证条件之一。在胚胎移植时通过改变传统的通过撕破囊膜后进行输卵管移植的手术方式可以降低术中出血的可能性。囊膜毛细血管较为丰富，撕破囊膜时候完全避免血管是比较困难的。不过囊膜是透明的，可以用吸卵管或细针头穿一个小口，吸卵管通过这个小口进入输卵管伞部移植受精卵。这样可以减少出血，降低输卵管部位术后和腹壁的炎性粘连。实验过程中我们也发现，改善和加强术后护理可以明显减少代孕母鼠术后死亡率，从而提高胚胎移植的成功率，获得更多的仔鼠，提高制作转基因小鼠的效率。通过对以上影响因素的优化，提高了胚胎移植成活率、基因整合率和转基因总效率。转基因动物的制作是实践性很强的技术，通过熟练技术方法，优化显微注射方法制作转基因动物的程序，转基因效率仍有提高的空间。
【】
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