关节软骨急性损伤后软骨细胞凋亡的实验研究

              作者：宋长志，杨淮海，董启榕

【摘要】  目的 探讨关节软骨急性损伤后软骨细胞的凋亡特点。方法 利用钻头钻孔造成兔膝关节软骨损伤，利用脱氧核糖核苷酸末端转酶介导的生物素脱氧尿嘧啶苷酸缺口末端标记法、透射电镜、流式细胞仪等方法对受损软骨进行检测。结果 损伤后软骨细胞出现坏死和凋亡，损伤后第4天软骨细胞凋亡率最大，凋亡细胞全层分布，主要分布在浅表层和中间层。结论 关节软骨损伤后软骨细胞发生凋亡，4 d达高峰，以后逐渐减少。提示关节软骨急性损伤后，早期抑制软骨细胞的凋亡对防治骨关节炎可能有十分积极的意义。

【关键词】  软骨；急性损伤；凋亡

　　Experimental Study on Chondrocyte Apoptosis Following Acute Osteochondral Injury

    Abstract：Objective  To explore the characteristics of chondrocyte apoptosis following acute osteochondral injury.Methods  Drill holes were created in rabbit knees.TUNEL，transmission election microscopy(TEM)，fluorescence?activated cell sorter(FACS) were applied to study the injured femoral condyles obtained at different intervals following drill injury.Results  On post?injury day 4，the injured cartilage specimens displayed  statistically significant increased overall level of apoptosis，most of apoptotic chondrocytes were confined to the superficial tangential zone and the middle zone.Conclusion  Chondrocyte apoptosis may contribute to the subsequent development of post?traumatic arthritis.It would be important to prevent the knee from post?traumatic arthritis by repressing chondrocyte apoptosis as early as possible.

    Key words：cartilage；acute lnjury；apoptosis

    细胞凋亡又称程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，特点是胞体缩小、DNA片断、出现凋亡小体以及炎症反应。细胞凋亡发生在对机械和热损伤、毒素、细胞因子、病毒和细菌等因素的应答中［1］。Kim等［2］的研究表明，软骨细胞的凋亡可能会导致创伤后骨关节炎的发生。软骨损伤后的病理改变及其引起创伤性关节炎发生的机制还不清楚，本实验通过对兔膝关节急性损伤模型的观察，探讨软骨急性损伤后细胞死亡的方式以及与骨关节炎发生之间的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物模型的制作 

　　选用新西兰大白兔，重2.5～3.0 kg。2％戊巴比妥钠静脉麻醉，双侧膝关节局部剪毛。参照Costouros等［3］介绍的方法，用2.0 mm直径的钻头钻孔造模。兔取仰卧位，四肢固定，膝关节屈曲。常规碘伏消毒，髌韧带内侧切口，过屈膝关节显露股骨内外髁承重面，用直径2.0 mm的钻头在股骨内外髁承重面钻孔，钻透全部软骨直至软骨下骨，深度2～3 mm，造成膝关节软骨机械性损伤。钻孔后，冲洗关节腔后逐层缝合，苏醒后分笼饲养，自由活动。

　　1.2  动物分组 

　　选用新西兰大白兔28只，体重2.5～3.0 kg。随机选择一侧膝关节造模，对侧作为对照。选择术后第0、2、4、7、10、14天和4周为观察时间点，并据此随机分为7组，即0 d(4只)、2 d(4只)、4 d(4只)、7 d(4只)、10 d(4只)、14 d(4只)、4周(4只)。另外再取新西兰大白兔20只，16只双侧膝关节钻孔造模致软骨损伤，作为损伤组，4只作为正常组(兔膝关节软骨细胞本身数目较少，一个损伤部位分离的细胞数不能满足流式细胞仪检测的要求。因此实验中双侧同样标准造模，将每只兔两侧股骨内外髁受损区分离的软骨细胞合在一起进行流式细胞计数检测)，用于流式细胞仪检测。

　　1.3  标本的采取 

　　术后各时间点空气栓塞处死动物快速采取标本。切取股骨内外髁钻孔区周围直径为3～4 mm全层软骨。各时间点标本经石蜡包埋切片，用于脱氧核糖核苷酸末端转酶介导的生物素脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记法(terminal deoxynucleotide transferase?mediated deoxyuridine?biotin nick end labeling，TUNEL)观察。第4天的标本同时切取小部分用于电镜观察。用于流式细胞仪检测的兔于术后第2、4、14天和4周空气栓塞处死(每点4只兔)，无菌操作下切取受损的软骨，宽约2～3 mm，置于离心管中，磷酸盐缓冲液冲洗，2 000 γ/min离心10 min去除上清液，0.25％的胰蛋白酶消化30 min，2 000 γ/min离心10 min去除上清液，0.2％Ⅱ型胶原酶，在37℃恒温培养箱内消化，每隔1 h吹打1次，4～6 h软骨碎片完全溶解，再经过滤、漂洗、计数制成细胞悬液( 大于 1×106/mL )，用于流式细胞计数检测。

　　1.4  透射电镜观察软骨细胞超微结构变化 

　　取术后第4天的受损软骨及对照侧正常软骨标本各2份。放入2％的戊二醛磷酸缓冲液中，置4℃冰箱48 h作前固定，将标本修整成宽约为1.0 mm的长条形，磷酸盐缓冲液漂洗后，再在1％的锇酸中后固定2 h。按常规漂洗、脱水、渗透，环氧树脂包埋，ULTRACUTE超薄切片机(德国REICHERT?JUNG)超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双染色，JEM?1200透射电镜(日本)观察、摄片(加速电压60kV)。

　　1.5  流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率 

　　将分离的软骨细胞PBS洗涤、过滤、计数成大于1×106/mL细胞悬液，加入PI染液，避光作用20 min，上机检测。FAcsc alibur流式细胞仪(美国BECTON DICKINSON)，cellquest获取软件采集数据，ModFit2.0DNA拟合软件进行细胞周期分析，得出结果。

　　1.6  TUNEL检测软骨细胞凋亡率 

　　取术后各时间点标本，在10％的中性福尔马林溶液中固定，固定时间大于48 h。递增浓度乙醇脱水，石蜡包埋。连续切片，切片厚度为5 μm。标本分别行HE染色和TUNEL末端标记，利用HE染色光镜下证实切片部位包含软骨损伤部位。TUNEL具体操作步骤详见Boehringer?Mannheim试剂盒操作说明，以TBS代替一抗作阴性对照，凋亡的细胞核呈棕黄色，采用双盲法，连续观察10个高倍视野计数每100个细胞中的阳性细胞数，取其平均值作为该标本的细胞凋亡率。

　　1.7  统计学分析 

　　计量资料用±s表示，实验组与对照组的比较采用两样本均数差别的t检验。

　　2  结  果

　　2.1  透射电镜观察 

　　正常的关节软骨细胞为圆形或椭圆形，位于软骨陷窝内，细胞表面有突起和皱褶，细胞膜下及胞质中有较多无界膜的空泡，核呈偏心位，核膜明显(见图1)。凋亡的软骨细胞突起消失，细胞从周围的基质中退缩，细胞核染色质浓缩、核膜消失，内质网扩张，线粒体形态无改变(见图2)。

　　2.2  流式细胞仪计数检测 

　　正常兔关节软骨和造模后各时间点受损区关节软骨经Ⅱ型胶原酶消化后，制成细胞悬液(细胞密度＞1×106/mL)，流式细胞仪检测结果(±s)。结果显示，关节软骨损伤后软骨细胞凋亡率增高，第4天凋亡率最高，以后呈下降趋势(见表1)。表1  用流式细胞仪检测关节软骨细胞凋亡率（略）

　　2.3  TUNEL结果 

　　关节软骨急性损伤后立即在紧靠钻孔区周围的软骨浅表层内出现很少数量的软骨细胞凋亡；伤后2 d凋亡的软骨细胞延伸到中间层，但主要局限在创伤孔周围1 mm的软骨区域内；伤后4 d凋亡率最高，凋亡的软骨细胞分布更加广泛，呈全层分布，距创伤孔延伸的更远；伤后14 d软骨细胞凋亡明显减少，仍主要分布在表浅层和移行层，深层较少；伤后4周在浅表层仍见到少量的软骨细胞凋亡(见图3～7，表2)。表2  TUNEL检测关节软骨细胞凋亡率  (略)

　　3  讨 论

    现已知道，软骨细胞凋亡(即程序性细胞死亡)，与软骨图3  正常的兔关节软骨细胞原位(TUNEL，×100)
损伤关系密切，并且可能与最终的创伤后骨关节炎的发生密切相关。Honkonen［4］观察到胫骨平台骨折患者于骨折后平均7.6年有44％的患者发生骨关节炎。Messner报道［5］，利用关节镜观察单纯膝关节软骨损伤患者，14年后有47％的患者发生骨关节炎。

    研究表明，在正常的肥大软骨细胞层中约有5％～10％的散在的凋亡软骨细胞存在［6］。我们在本实验中观察到：正常的兔软骨细胞的凋亡率，流式细胞仪检测结果为(3.88±1.49)％，TUNEL检测结果为(4.78±0.45)％；钻孔造模后软骨细胞凋亡在第4天达最高峰，流式细胞仪检测有(60.69±4.78)％的软骨细胞发生凋亡，TUNEL检测有(68.21±5.72)％的软骨细胞发生凋亡，以后逐渐减少。这个结果和其他研究者的结果基本一致。Tew［6］研究发现，不论是发育成熟的还是未成熟的关节软骨，在遭受环锯损伤1周后与正常组比较，凋亡的软骨细胞数量增多。

　　Costouros等［3］也在急性关节内软骨损伤后活体内和体外培养的软骨细胞的凋亡比较研究中发现，不论是在活体内还是在体外培养的受损软骨，在损伤后的第4天凋亡的软骨细胞数最多。D′Lima［7］也报道，在人的关节软骨遭受冲击负荷损伤后的第4天，分离软骨块的软骨细胞凋亡率为32％；在兔的膝关节活体冲击负荷损伤模型中，第4天测得的软骨细胞凋亡率为34％。Chen等［8］在其犬的肱骨头冲击负荷损伤实验中，持续冲击负荷损伤2 h后，损伤区软骨块体外培养48 h，TUNEL法测得的软骨细胞凋亡率高达74％。

    另外，我们在实验中还观察到：凋亡的软骨细胞绝大部分局限在关节软骨的表浅层和中间层，深层较少。Lucchinetti［9］在他的实验中，使软骨重复负荷后检测软骨细胞的生存能力，也发现凋亡的软骨细胞主要位于表浅层和中间层，深层较少见。这种现象可能是由于关节软骨各层的软骨细胞存在着形态和表型的差异，导致各层的软骨细胞对机械损伤的敏感程度也不一致。这些特点可能保护了深层的软骨细胞在关节软骨受到损伤后免于凋亡。

    自凋亡细胞研究以来，检测方法较多，但各有优缺点。早期有研究者用扫描电镜，后来被特异性较强的透射电镜所替代，因其可找到凋亡小体，但透射电镜却无法做到定量检测。而流式细胞仪室虽可以定量，却不能反映凋亡细胞的分布特点。由于凋亡细胞内形成大量含有3′羟基末端的DNA双联片断，因此借助于末端转移酶或DNA多聚酶，可对这些断段进行特异性的标记(TUNEL法或TdT法)。这是一种检测凋亡细胞的特异性手段，可以使凋亡细胞在原位被特异性地标记和显示出来，既能进行定量检测，又能反应凋亡细胞在空间上的分布特点。其缺点是不典型凋亡或混杂有大量坏死细胞时，可能给标记带来一定的干扰，甚至出现假阳性，因此需结合其他一般形态学检测方法加以判断。本实验结合几种方法从不同角度证实了创伤后凋亡的存在，反映了创伤后软骨细胞凋亡的时间和空间特点。

    创伤后软骨细胞发生凋亡的确切机制尚不清楚，创伤后会导致软骨细胞密度降低、软骨基质降解、关节内力学环境改变、部分细胞因子的高表达，这些因素可能会激发Fas和NO两种途径共同作用诱导软骨细胞凋亡。Lotz等在OA患者和OA实验动物模型中观察到软骨细胞呈现大量凋亡，在关节软骨表面的细胞表达Fas抗原。同时在含有凋亡细胞的关节软骨区域糖蛋白减少，凋亡细胞的数量与NO含量及OA病变程度呈正相关。

    关节软骨损伤后会发生软骨细胞的凋亡，而软骨细胞的凋亡与骨关节炎的发生密不可分，所以搞清楚急性损伤后软骨细胞的凋亡特点对骨关节炎的防治有着十分重要的意义。本实验结果提示关节软骨急性损伤后的特点是急性损伤软骨细胞发生坏死和凋亡，软骨细胞凋亡4 d达高峰，以后逐渐减少，伤后4周仍有凋亡的软骨细胞持续存在。

【】
  　　［1］Nakazawa F，Matsuno H，Yudoh K，et al.Corticosteroid treatment induces chondrocyte apoptosis in an experimental arthritis model and in chondrocyte cultures［J］.Clin Esp Rheumatol，2002，20(6)：773?781.

　　［2］Kim HT，Lo MY，Pillarisetty R.Chondrocyte apoptosis following intra?articular fracture in humans［J］.Osteoarthr Cartilage，2002，10(9)：747?749.

　　［3］Costouros JG，Dang AC，Kim HT.Comparison of chonrocyte apoptosis in vivo and in vitro following acute osteochondral injury［J］.J Orthop Res，2004，22(3)：678?683.

　　［4］Honkonen SE.Degenerative arthritis after tibial plateau fracture［J］.J Orthop Trauma，1995，9(4)：273?277.

　　［5］Messner K，Maletius W.The long?term prognosis for severe damage to weight?bearing cartilage in the knee：a 14?year clinical and radiographic follow?up in 28 young athletes［J］.Acta Orthop Scand，1996，67(2)：165?168.

　　［6］Tew SR，Kwan AP，Hann A，et al.The reaction of articular cartilage to experimental wounding：role of apoptosis［J］.Arthritis Rheum，2000，43(1)：215?225.

　　［7］D′Lima DD，Hashimoto S，Chen PC，et al.Impact of mechanical trauma on matrix and cells［J］.Clin Orthop Relat Res，2001，(391)：90?99.

　　［8］Chen CT，Burton?Warster N，Borden C，et al.Chondrocyte necrosis and apoptosis in impact damaged articular cartilage［J］.J Orthop Res，2001，19(4)：703?711.

　　［9］Lucchinetti E，Adams CS，Horton WE jr，et al.Cartilage viability after repetitive loading：a preliminary report［J］.Osteoarthritis Cartilage，2002，10(1)：71?81.