柘木多糖和枸杞多糖对尾吊小鼠免疫功能的防护效应*
【摘要】 目的 研究柘木多糖和枸杞多糖对尾吊小鼠细胞免疫功能的防护作用。方法 分别以柘木多糖、枸杞多糖的高、低剂量经口给予尾吊小鼠，MTS比色法测定脾T淋巴细胞增殖，ELISA法测定培养上清中细胞因子分泌评价免疫功能。结果 尾吊7 d后，小鼠脾T淋巴细胞增殖明显降低，细胞因子IL?2和IFN?γ分泌减少，柘木多糖能提高尾吊小鼠的脾T淋巴细胞增殖及IL?2和IFN?γ分泌。结论 柘木多糖对尾吊模拟微重力小鼠细胞免疫功能有一定的防护作用。
【关键词】 失重模拟 尾吊 柘木多糖 枸杞多糖(LBP 免疫功能
Protective Effects of Cudrania Tricuspidata Polysaccharides and Lycium Barbarium Polysacharides on the Immune Function of Tail?suspended Mice.SONG Jin?ping, ZHANG Hong?yu,QU Li?na, YANG Fen, LIU Shao?fang, WANG Hong?hui,LIU Yue,XIONG Jiang?hui.Space Medicine & Medical Engineering,2007,20(6):402~405
Abstract:Objective To study the protective effects of Cudrania tricuspidata polysaccharides(CPS) and Lycium barbarium polysacharides(LBP) on the cellular immune function in tail?suspended mice.Methods Two dosages of CPS and LBP were administrated to tail?suspended mice orally respectively. Splenic T lymphocyte proliferation were determined by MTS colorimetric assay and cytokines production in supernatants obtained from cultured spleen cells after stimulation with ConA were detected by ELISA assay. Results Splenic T lymphocyte proliferation and the levels of IL?2 and IFN?γ decreased significantly in tail?suspended mice 7 d later, which could be enhanced by administration of CPS. Conclusion CPS has protective effects on cellular immunity of tail?suspended mice which is under simulated microgravity.
Key words:weightlessness simulation;tail?suspension;cudrania tricuspidata polysaccharides；lycium barbarum polysaccharides;immune function
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多糖是由单糖连接而成的多聚物，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有较明确的抗肿瘤、提高免疫功能的作用，不同种类的多糖对于细胞免疫功能、体液免疫功能、巨噬细胞功能、NK细胞(natural killer cells)功能分别有不同的激活作用［1?5］。柘木多糖是近年由山东大学徐誉泰教授从柘树根中首先提取并初步研究了其免疫增强功效；枸杞是传统中药，枸杞多糖作为枸杞的有效成份，其免疫调节作用已受到广泛研究和公认［6］。
空间飞行条件下，航天员受到超重、微重力、振动、噪音、辐射、孤独、睡眠缺失等多方面的影响，细胞免疫功能受到抑制［7?9］，航天员容易发生感染性疾病、潜伏病毒活化等及其并发症，这已成为中长期飞行和星际飞行的主要障碍之一，而目 前尚未找到对抗航天免疫功能下降的有效措施。为了解多糖对空间免疫效应的干预效果，本研究用尾吊小鼠作为空间微重力的地面模拟模型，分别给予柘木多糖(CPS)和枸杞多糖(LBP)，研究这两种多糖对尾吊小鼠免疫功能的防护作用。
方 法
药物及主要试剂 柘木多糖由山东大学陈靠山教授实验室制备，枸杞多糖由南通四海植物精华有限公司制备，多糖分别为用生理盐水配至所需浓度，MTS为Promega公司产品，RPMI1640、ConA、PMS为Sigma公司产品，胎牛血清为Hyclone公司产品。IL?2、IFN?γ ELISA试剂盒为晶美生物工程公司进口分装产品。
动物分组及给药 BALB/c小鼠，雌性，体重（20±2）g (北京维通利华实验动物中心)。小鼠随机分成6组，每组8只，分别为正常对照组（Con)、尾吊组(HU)、尾吊加柘木多糖［分为高剂量组(HU+CPSH)1 000 mg/(kg·d)和低剂量组(HU+LBPL)500 mg/(kg·d)］ 、尾吊加枸杞多糖［分为高剂量组（HU+LBPH)800 mg/(kg·d)和低剂量组(HU+LBPL)400 mg/(kg·d)］。给药组每天灌胃给药0.5 mL，正常对照组、尾吊组用等量生理盐水灌胃。除正常组外，小鼠均尾部悬吊，与地面呈30°夹角。
T淋巴细胞增殖测定 常规制备小鼠脾淋巴细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为4×106/mL，接种于96孔培养板，每孔加入细胞悬液100 μL, 每样8个复孔，均分为对照孔和ConA刺激孔，ConA终浓度为5 μｇ/mL，置37℃, 5%CO2饱和湿度培养箱中培养66 h。
MTS比色法测定T淋巴细胞增殖：每孔加MTS/PMS混合液20 μL，继续培养3 h，在酶标测定仪波长为492 nm处测定光密度(A)值。T淋巴细胞增殖=加ConA刺激孔A值-未加ConA对照孔A值。
培养上清中IL?2、IFN?γ含量的测定 将上述浓度的小鼠脾淋巴细胞悬液加入48孔板，每孔1 mL，ConA刺激，终浓度为5 μｇ/mL。置37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养48 h和72 h，取培养上清离心后，-70℃分装冻存。48 h培养上清用于IL?2测定，72 h培养上清用于IFN?γ测定。先用ELISA法进行预实验确定样本的稀释倍数，再进行样本的正式测定。
统计分析 文中数据均以x±sx表示，采用SPSS11.5软件处理数据，用单因素方差(one?way ANOVA)检验，以P<0.05为具有统计学意义。
结 果
〖HT5H]多糖对尾吊小鼠T淋巴细胞增殖的影响 从图1中看出，经7 d尾吊后，小鼠脾脏T淋巴细胞增殖较对照明显下降(P<0.05)，柘木多糖和枸杞多糖的高、低剂量组均能提高尾吊小鼠的T淋巴细胞增殖，其中尾吊+柘木多糖高、低剂量组与尾吊小鼠组相比有显著性差异(P<0.05)。
多糖对尾吊小鼠脾淋巴细胞分泌IL?2的影响 如图2所示，经7 d尾吊后，小鼠脾脏T淋巴细胞分泌IL?2能力较对照显著下降(P<0.01)，柘木多糖低剂量与枸杞多糖高剂量均能提高尾吊小鼠T淋巴细胞IL?2分泌水平(P<0.05)。与尾吊组相比有显著性差异(P<0.01)。
讨 论
空间飞行对机体免疫功能的影响主要是对细胞免疫功能的抑制，细胞免疫功能在机体免疫功能中起中心作用。T淋巴细胞增殖是细胞免疫功能的主要指标，即在外来免疫原或丝裂原的刺激下，淋巴细胞发生增殖，产生功能细胞因子，对多种免疫细胞产生激活促进作用，从而对外来病原体和自身变异细胞起到杀灭或抑制作用，反映机体在受到外来病原体或内在变异因子侵袭时淋巴细胞的反应能力。细胞因子IL?2和IFN?γ是由激活的T淋巴细胞（Th1细胞）分泌的功能因子，是T淋巴细胞功能的另一项重要指标。其中IL?2是促进T淋巴细胞增殖的重要因子，能上调高亲和度IL?2受体的表达，IL?2与高亲和力IL?2受体的结合导致T淋巴细胞分裂。IFN?γ能促进T淋巴细胞的增殖和功能的实现，并对其它免疫细胞功能具有调节作用，如促进NK细胞增殖和杀伤功能，诱导和提高LAK和CTL杀瘤活性及其相关细胞因子的分泌。
尾吊是地面啮齿动物模拟失重的有效模型［10］，研究表明，尾吊抑制了啮齿动物的免疫反应，削弱其抗感染能力［11?13］。本研究中，尾吊7 d后，小鼠脾脏T淋巴细胞增殖较对照明显下降，T淋巴细胞分泌的功能细胞因子IL?2和IFN?γ下降，与Aviles研究结果有所不同［12］，可能是由于所用小鼠种属不同，免疫反应有一定差异。同时，本研究中，尾吊小鼠胸腺明显萎缩，胸腺重量显著下降（数据未显示），提示免疫功能的抑制与应激引起的神经内分泌反应有关。
柘树是一种传统抗癌中草药。徐誉泰发现柘树根水煎剂的主要有效成分为多糖和黄酮类化合物，并首次从柘木根中提取出柘木多糖，该多糖对小鼠S180肿瘤的抑制率达57％，同时发现腹腔给药能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞过氧化物酶的活性、吞噬功能及细胞毒活性，认为柘木多糖通过调节机体的免疫功能而起到抗肿瘤作用［1］。我们在前期实验中首次观察了该多糖的体外免疫调节作用，结果表明：柘木多糖进一步分离纯化出的3种多糖，体外能直接刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，协同ConA增强脾淋巴细胞增殖，并促进小鼠腹腔巨噬细胞的呑噬功能，表明柘木多糖对免疫细胞有直接激活作用，免疫细胞膜上可能存在此类多糖受体［14］。在本实验中，进一步研究了柘木多糖对在体细胞免疫功能的作用，并与已经广泛研究、公认具有良好免疫调节作用的同类物质——枸杞多糖相比较。
从本实验看出，500 mg/kg和1 000 mg/kg剂量柘木多糖灌胃给药对尾吊小鼠引起的T淋巴细胞增殖功能下降均有防护作用，高剂量组较低剂量组效果更佳。同时，低剂量组能增加Th1细胞IL?2分泌水平，高剂量组则对Th1细胞分泌IFN?γ有显著促进作用。多糖不同剂量对细胞免疫功能各指标的保护作用并不完全一致，可能是因为多糖对免疫细胞的效应存在几种不同的作用途径。
枸杞为茄科植物的成熟果实,微寒无毒性,味甘平,是我国名贵中药。《药典》记载枸杞子有滋肾益精、明目之效。枸杞多糖是从传统中药枸杞子中提取的有效成份，免疫增强作用是其主要药理作用。研究表明枸杞多糖能使正常小鼠外周白细胞数目增加，提高免疫抑制小鼠Th细胞的数量，提高Th/Ts比值，增强T淋巴细胞转化及NK细胞的杀伤活性［2?3］。在本实验中，枸杞多糖对尾吊小鼠引起的细胞免疫功能下降也有一定的提升趋势，但效果不及柘木多糖。
本次实验还表明，两种多糖对尾吊引起的胸腺萎缩没有防护作用（数据未显示），表明多糖并没有阻断应激引起的免疫效应，多糖对尾吊小鼠免疫功能的防护可能与多糖对免疫细胞的直接激活作用有关。
Aviles［12］的研究也表明，从蘑菇担子菌中提取活性糖相关复合物(AHCC)能增强尾吊小鼠的免疫功能。可增加脾细胞分泌IL?2和IFN?γ，但对脾细胞增殖无影响，表明AHCC能减轻尾吊模型对免疫的不良效应，与我们的结果有相同趋势。
多糖属天然产物，对机体毒性低或无毒性，柘木多糖是山东大学近年来新提取的植物多糖，现由我室和山东大学联合研发，本研究首次观察了它对在体细胞免疫功能的调节作用，并首次将它用于航天免疫研究中，表明该多糖能显著提升模拟失重引起的细胞免疫功能下降，并优于传统的枸杞多糖，在未来中长期空间飞行航天员免疫调节药物中具有潜力和优势。
（致谢：本课题中所用柘木多糖由山东大学生命院陈靠山教授提供，在此表示衷心的感谢。）
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