EB病毒gp85 N端片段的原核表达与初步鉴定

                   作者：涂向东 吴玉水 邱龙翔 连云宗 程烽 兰风华 朱忠勇

【关键词】  EB病毒;,gp85,N端片段;,表达;,免疫原性

　　Prokaryotic expression and characterization of Nterminal truncated glycoprotein gp85 of EpsteinBarr virus

　　[Abstract]AIM: To construct a prokaryotic recombinant vector of EpsteinBarr virus (EBV) membrane protein gp85, to express the protein in E.coli and characterize the antigenicity of this nonglycosylated protein. METHODS: The BXLF2 gene coding   5′terminal truncated of EBV gp85 was amplified from the EBV strain B958 cell line with specific primers. After identification by the restriction digestion with Hind III and Xho I, the PCR product was inserted into the prokaryotic expression plasmid pGEX5T and confirmed by sequencing. The constructed prokaryotic expression vector pGEX5T85N was transformed into the competent E.coli BL21. The expressed recombinant protein gp85N was purified by affinity chromatography, characterized by Western blot, and used immunize BALB/c mice. The titer of antisevum from the immunized mice was detected by ELISA. RESULTS: Sequencing analysis revealed that the obtained truncated BXLF2 gene was identical to that published in GenBank and successfully cloned into pGEX5T. SDSPAGE showed that the expressed recombinant protein was partially soluble with a relative molecular mass of 45000. ELISA results indicated that the expressed gp85N was recognized by that the antigp85 mAb and contiserum with high titer was obtained from the immunized mice. CONCLUSION:  The obtained recombinant gp85N with an excellent antigenicity should provide preliminary data for characterization of the antibody produced by the immunized mice.

　　[Keywords]EpsteinBarr virus; N terminal fragment of gp85; expression; immunogenicity

　　[摘 要]  目的: 构建EB病毒基因的原核表达载体, 并在大肠杆菌中进行表达。分析非糖基化的EB病毒包膜糖蛋白gp85 N端截短片段的抗原性。方法: 采用基因工程技术, 以B958细胞（美洲绒猴外周血B淋巴细胞经EBV转化后的细胞系）[1]培养上清为模板, 用 PCR扩增EB病毒的BXLF2基因N端片段。PCR产物经Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切, 插入原核表达载体pGEX5T中, 构建pGEX5T85N重组表达质粒, 并在大肠杆菌BL21中诱导表达gp85N蛋白。纯化表达的蛋白用Western blot鉴定, 并免疫BALB/c小鼠。结果: 序列分析表明, 插入片段的序列与GenBank登录的序列完全一致。重组表达的蛋白的相对分子质量（Mr）约为45000, 同预期的大小相符。以纯化的可溶性重组蛋白免疫BALB/c小鼠, 经ELISA检测获得了高效价的抗血清,   且抗gp85单克隆抗体（mAb）可识别所表达的gp85N抗原。Western  blot显示, 该抗原可与小鼠免疫血清起特异性反应。结论: 表达并纯化的EB病毒截短的gp85N重组蛋白具有良好的抗原性,  为下一步分析所产生抗体的生物学特性提供了条件。

　　[关键词]EB病毒; gp85 N端片段; 表达; 免疫原性

　　EpsteinBarr 病毒（EBV）属于疱疹病毒科γ疱疹病毒亚科成员, 具有潜在的致癌性。该病毒在人类的感染率高达95%, 主要感染B细胞和上皮细胞, 是传染性单核细胞增多症、 Burkitt淋巴瘤及鼻咽癌等多种肿瘤的重要致病因素。EBV对B细胞有高度的亲和力, 其穿入B细胞时需要多种糖蛋白复合物的参与。其中糖蛋白gp85在病毒吸附和穿入靶细胞中起重要作用, 是抗EBV感染的重要靶抗原之一[2-5]。EBV的gp85由BXLF2基因编码, 其膜外区(N端)的抗原性较强, 而且与EBV感染的关系密切。我们将BXLF2 基因N端589 bp的片断克隆至pGEX5T质粒中, 构建了pGEX5T85N重组载体。将其转入宿主菌BL21中,  在大肠杆菌内诱导表达了gp85N重组蛋白, 采用谷胱甘肽琼脂糖珠对其进行纯化并对其免疫学特性进行了初步研究。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  EB病毒B958细胞由第四军医大学免疫学教研室提供。原核表达载体pGEX5T及大肠杆菌BL21由本室保存。各种限制性内切酶、 T4连接酶及蛋白marker均购自TaKaRa公司, 引物由上海生物工程公司合成。质粒抽提、 胶回收试剂盒购自上海华舜公司。二硫苏糖醇（DTT）及还原型谷胱甘肽, 由厦门泰京生物工程公司提供。Bradford法测定蛋白试剂盒, 购自上海申能博彩公司。福氏佐剂及谷胱甘肽琼脂糖珠, 购自Sigma公司。BALB/c雌性小鼠购自上海中科院动物实验中心。HRP标记的羊抗鼠IgG购自ZYMED 公司。抗gp85的单克隆抗体（mAb）由美国Florida 大学HuttFletcher博士赠送。其他常规化学试剂均为分析纯。PE2400型DNA扩增仪 ABI公司产品。Trans Blot SD半干电转印仪及FluorSTM Multilmager凝胶成像系统为BioRad公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  BXLF2基因N端片段的PCR扩增  根据EB病毒的膜蛋白gp85 BXLF2基因的序列, 设计一对引物。P1: 5′CG AAG CTT TGC AGT TGC TCT GTG TT3′含Hind Ⅲ酶切位点, P2: 5′CG CTC GAG ATG CAG TTG CTC TGT GTT3′含XhoⅠ酶切位点。以EB病毒B958细胞为模板, 总PCR反应体积为50 μL, 包括引物P1、P2 各30 pmol, dNTP 125 μmol/L及Taq DNA聚合酶2 U。PCR扩增条件: 94℃预变性2 min, 94℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共30个循环后, 于72℃再延伸5 min。PCR产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

　　1.2.2  重组质粒的构建和转化  将上述PCR产物分别用Hind Ⅲ和XhoⅠ双酶切, 并与同样双酶切的GST融合表达载体pGEX5T进行连接, 构建pGEX5T85N。以重组质粒转化感受态E.coli BL21细胞, 阳性克隆进行双酶切鉴定, 并将菌液送上海生物工程公司进行DNA序列测定。

　　1.2.3  GSTgp85 N融合蛋白的诱导表达  挑取重组菌的单个菌落, 接种于25 mL LB(含氨苄青霉素)培养基中, 于37℃摇床培养过夜。次日, 按1∶30转种于500 mL LB培养基中, 于37℃振荡培养至A600=1.0左右, 加IPTG（终浓度为0.4 mmol/L）于18℃诱导表达20 h; 同时取1管未加IPTG作为阴性对照。菌液离心, 收集菌体, 重悬于8 mL PBS（含10 mL/L Triton X100 及1 g/L溶菌酶）中, 于-70℃反复冻融以裂解菌体。以10000 g离心收集上清和菌体沉渣, 分别取少量进行100 g/L SDSPAGE。

　　1.2.4  重组蛋白的纯化  取上述菌体的裂解上清, 按说明书的方法, 用谷胱甘肽亲和层析柱进行分离纯化, 纯化产物的纯度经100 g/L SDSPAGE进行分析。

　　1.2.5  小鼠抗gp85N抗血清的制备  以Bradford法测定蛋白浓度, 按100 μg纯化的gp85N抗原加入等体积的福氏完全佐剂, 乳化后采用皮内、 背部多点注射免疫5只6周龄的BALB/c雌性小鼠。初次免疫后, 每隔3周用同样抗原加等体积福氏不完全佐剂加强免疫2次。

　　1.2.6  抗血清效价的测定  经优化条件, 将纯化的gp85N抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释至10 mg/L包被酶标微孔板, 于4℃过夜。以PBS洗涤后, 加含10 g/L BSA的PBS封闭2 h。充分洗涤后, 分别加入不同稀释度和不同免疫周期的小鼠血清及抗gp85 mAb, 同时以PBS免疫小鼠的血清作为空白对照, 以HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为二抗, 用底物TMB显色后, 于波长450 nm处测定抗血清的效价。

　　1.2.7  目的蛋白表达的Western blot 分析  目的蛋白gp85N经SDSPAGE后, 用Trans blot SD半干电转印仪转移至硝酸纤维素膜上, 用含30 g/L BSA的PBS 4℃封闭过夜。洗涤后, 依次滴加小鼠免疫血清（室温孵育1 h, 以PBST洗3次）及HRP标记的羊抗鼠IgG（同上孵育及洗涤）, 经30 mL/L H2O2和3 g/L4氯1萘酚显色后观察结果。

　　2  结果

　　2.1  BXLF2基因N端片段的扩增  BXLF2基因N 端片段的PCR产物经10  g/L琼脂糖凝胶电泳显示, 在Mr约为589 bp处有一扩增条带, 同预期的目的基因片段的大小相一致（图1）。

　　图1  BXLF2基因N 端片段PCR产物的琼脂糖分析（略）

　　Fig 1  Analysis  of the PCR product of N terminal fragment of BXLF2 gene by agarose gel electrophoresis

　　1: N terminal fragment of BXLF2 gene; M: DNA marker DL 2000.

　　2.2  pGEX5T85N重组质粒的酶切鉴定  pGEX5T85N重组质粒经Hind Ⅲ和Xho Ⅰ双酶切后, 出现约5000 bp的pGEX5T和约589 bp的目的基因片段, 与理论值相符（图2）。

　　图2  pGEX5T85N重组质粒的酶切鉴定（略）

　　Fig 2  Restriction enzyme  digestion analysis of the recombinant plasmid pGEX5T85N

　　M: DNA marker DL 15000; 1: pGEX5T plasmid; 2: Recombinant plasmid pGEX5T85N; 3: pGEX5T85N/Hind Ⅲ+XhoⅠ; 4: N terminal fragment of BXLF2 gene.

　　2.3  pGEX5T85N重组质粒DNA序列测定  序列测定结果表明, 重组质粒中所含的目的基因片断与BXLF2基因片段的阅读框序列（GenBank中的登录号为VO1555）完全一致, 证明该重组质粒已插入了目的基因片断（图3）。
　
　　图3  pGEX5T85N重组质粒的部分DNA序列（略）

　　Fig 3  The partial DNA sequence of pGEX5T85N gene

　　2.4  gp85N蛋白的诱导表达  经IPTG诱导后, pGEX5T85N转化菌的菌体裂解物中, 新出现1条Mr约为45000的蛋白带, 同预期的融合蛋白GST85N的Mr相符; 而未经诱导的菌体则无此条带出现（图4）。

　　图4  表达的gp85N蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　Fig  4  Analysis of  expressed  gp85N  recombinant protein by SDSPAGE

　　1: Lysate of bacteria transformed with pGEX5T without induction; 2: Lysate of bacteria transformed with pGEX5T with IPTG induction; 3: Lysate of bacteria transformed with pGEX5T85N without induction; 4, 5: Lysate of bacteria transformed with pGEX5T85N with IPTG induction; M: Protein marker.

　　2.5  重组gp85N蛋白的纯化  将pGEX5T85N转化的表达菌经-70℃反复冻融后, 上清液中有部分可溶性的目的蛋白。将其用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化后, 在Mr为45000处有1条较纯的蛋白表达条带, 同预期蛋白的大小一致(图5)。

　　图5  纯化前后表达的重组gp85N蛋白的SDSPAGE分析（略）

　　Fig 5  SDSPAGE analysis of expressed the recombinant gp85N protein

　　1: Supernatant of expressed bacteria after disintegration; 2: Precipitation of expressed bacteria after disintegration; 3: Purified GSTgp85N fusion protein; M: Protein marker.

　　2.6  抗血清效价的ELISA检测  以免疫前的小鼠血清及用PBS免疫的小鼠血清作为阴性对照, 将收集的不同免疫时间段的小鼠抗血清和抗gp85 mAb作倍比稀释后, 用间接ELISA法测定免疫小鼠血清和与mAb的免疫活性, 以P/N≥2.1的血清最高稀释度为抗体效价。结果表明, 免疫8周的小鼠抗血清的效价达1∶24000, mAb的效价为1∶200。

　　2.7  gp85N蛋白的Western blot分析  本实验中同时在大肠杆菌体中表达了主要以包涵体形式存在的gp85全长蛋白。将gp85全长蛋白及gp85N与小鼠免疫血清进行Western blot分析。结果表明, 重组gp85N蛋白具有良好的免疫原性, 能特异性地识别gp85全长蛋白（图6）。

　　图6  gp85全长蛋白和gp85N与小鼠免疫血清反应的Western blot分析（略）

　　Fig 6  Analysis of reaction of fulllength gp85 protein and gp85 N to mouse immune serum by Western blot

　　1: Lysate of bacteria transformed with fulllength gp85 with IPTG induction; 2: Lysate of bacteria transformed with fulllength gp85 without induction; 3: Purified GSTgp85N fusion  protein; 4: Lysate of bacteria transformed with pGEX5T without induction. 

　　3  讨论

　　gp85由BXLF2基因编码, 分为胞外区、 胞内区和跨膜区, 全长838个氨基酸。国外的研究实验证明, 抗gp85 mAb可中和EB病毒, 并能引起特异性CTL应答[6, 7],有效地阻断EB病毒感染上皮细胞和进入B细胞, 对抗EB病毒感染起重要作用。目前预防EB病毒感染最安全有效的方法是接种基因工程疫苗。大多数人工合成疫苗都是重组蛋白。原核表达载体是一种十分有效的表达外源基因的方法, 它不仅廉价、 易于掌握, 而且能模拟外源蛋白的一级氨基酸结构, 正确表达蛋白质。本研究中, 我们用PCR从EB病毒转化的B958细胞中扩增了编码BXLF2基因的N端, 并将其插入原核表达载体pGEX5T中。该载体中含有谷胱甘肽转移酶（GST）编码基因, 可与目的基因进行高效融合表达, 并增强表达蛋白的稳定性和可溶性。表达产物经谷胱甘肽Sepharose亲和层析后,  可获得较纯的gp85NGST融合蛋白。为了尽可能获得可溶性蛋白, 我们对诱导蛋白表达的条件作了摸索:  选用0.4 mmol/L IPTG, 于18℃诱导表达20 h, 诱导表达了部份可溶性蛋白。该蛋白可保持天然构象, 以纯化的表达蛋白免疫小鼠证实其具有较强的免疫原性。Westen blot分析显示, 抗gp85N的抗血清不仅能与gp85N发生特异性免疫反应, 还可识别全长的gp85蛋白。另外, 表达的gp85N蛋白还可与抗gp85 mAb起反应。EB病毒截短的gp85重组蛋白的成功表达与纯化, 为下一步分析其所产生的抗体的生物学特性提供了条件。

　　致谢: 对第四军医大学免疫学教研室提供B958细胞, 美国Florida大学HuttFletcher博士赠送gp85 mAb深表感谢!

　　:

　　[1] Muller S, Neusser MO, Brien PC, et al. Molecular cytogentic characterization of the EBVproducing cell line B958 (Saguinus oedipus, Platyrrhini)by chromosome sorying and painting[J]. Chromosome Res, 2001, 9(8): 689-693.

　　[2] Urquiza M, Suarez J, Lopez R, et al. Identifying gp85regions involved in EpsteinBarr virus binding to Blymphocytes[J]. Biochem  Biophys Res Commun, 2004, 319(1): 221-229.

　　[3] Oda T, Imai S, Chiba S, et al. EpsteinBarr virus lacking glycoprotein gp85 cannot infect B cell and epithelial cells[J]. Virology, 2000, 276(1): 52-58 .

　　[4] Bornkamm GW, Hammerschmidt W. Molecular virology of EpsteinBarr virus[J]. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2001, 356(1408): 437-459.

　　[5] Kawa K. EpsteinBarr virus associated diseases in humans[J]. Int J Hematol, 2000, 71(2): 108-117.

　　[6] Pulford D, Lowrey P, Morgan AJ. Expression of the Epsteinbarr virus envelope fusion glycoprotein gp85 gene by a recombinant baculovirus[J]. J Gen Virol, 1994, 75(11): 3241-3248.

　　[7] Khanna R, Sherritt M, Burrows SR. EBV structural antigens gp350 and gp85 as targets for ex vivo virusspecific CTL during acute infectious mononucleosis: Potential use of gp350/gp85 CTL epitopes for vaccine design[J]. J Immunol, 1999, 162(5): 3063-3069