负载甘露糖化抗原的DC诱导的特异性杀伤
作者：钟国成, 徐明, 施明, 胡美茹, 闵敏, 陈健
【关键词】 树突状细胞;,糖基化抗原;,肿瘤免疫
Specific cytotoxicity of CTL which was induced by DC pulsed with mannosylated antigen
[Abstract] AIM: To investigate the role of mannosylated tumor antigen in the course of antitumor response. METHODS: L2 domain of HER2/neu (ErbB2) ectodomain was expressed in E.coli, purified and mannosylated. Dendritic cells(DCs) were induced from human peripheral blood mononuclear cell by GMCSF and IL4. The maturation and functional capacity of DCs pulsed with mannosylated L2 (mL2) protein was investigated. RESULTS: L2 protein could induce DC maturation, which was accompanied by elevated expression of MHC and costimulatory molecules. The effect of mL2 protein on DC maturation was more remarkable than that of nonmannosylated L2 protein. Furthermore, DCs pulsed with mL2 could stimulate high tumor cell lysis by CTL. CONCLUSION: Our experiment provide the foundation for the study of new tumor vaccine by mannosylation.
[Keywords]dendritic cells; mannosylated antigen; tumor immunity
[摘 要] 目的: 探讨甘露糖化肿瘤疫苗在抗肿瘤免疫中的作用。方法: 纯化出目的蛋白HER2/neu胞外配体第2结构域（RLD2）, 并对其进行糖基化修饰, 自外周血单核细胞诱导产生CD83+的DC, 利用DC表面的甘露糖受体, 使DC负载甘露糖基化的目的抗原mRLD2(mL2), 并致敏T淋巴细胞, 观察CTL特异性杀伤SKBR3细胞的效果。结果: 较之未进行糖基化修饰的目的蛋白RLD2（L2）, mL2能促进DC的成熟, 并能诱导出具有更强杀伤效力的CTL。结论: 本实验的结果为开展新型甘露糖化肿瘤疫苗的研制提供了理论依据。
[关键词]树突状细胞; 糖基化抗原; 肿瘤免疫
目前, 基于DC的肿瘤疫苗研究是肿瘤免疫研究领域的热点。我们纯化出目的蛋白HER2/neu胞外配体第2结构域（RLD2）, 并对其进行糖基化修饰, 然后应用当前普遍采用的rhGMCSF、 rhIL4培养体系, 自外周血单核细胞诱导产生CD83+的DC, 利用DC表面的甘露糖受体可介导高效的抗原内化, 使DC负载甘露糖基化的目的抗原mRLD2(mL2), 促进DC的成熟, 并致敏T淋巴细胞, 产生的CTL能特异性杀伤高表达HER2/neu的SKBR3肿瘤细胞。较之未进行糖基化修饰的目的蛋白RLD2（L2）, mL2能促进DC的成熟, 并且诱导出具有更强杀伤效力的CTL。
1 材料和方法
1.1 材料 pTIGTrx 载体由军事医学院生物工程研究所赵志虎博士构建; 高表达HER2/neu的人乳腺癌细胞系SKBR3细胞、 不表达HER2/neu的人乳腺癌细胞系MDA435细胞, 大肠杆菌JM109及BL21(DE3)均由军事医学科学院基础医学研究所分子免疫学实验室保存; 含RLD2的原核表达载体GpTIGTrxA/RLD2由徐明硕士构建。DEAESepharose FastFlow柱购自Pharmacia公司; 镍离子亲和层析柱为CLONTECH公司产品; 异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）为Promega公司产品; 蛋白质Mr标准品购自上海生物化学研究所; αD甘露吡喃异硫氰酸苯酯为SIGMA公司产品; 4甲基吗啉购自Fluka公司; 二甲基亚砜购自北京石鹰化工厂ReflexⅢ型质谱仪为德国Bruker公司产品。rhGMCSF、 rhIL4购自Peprotech EC公司; RPMI1640完全培养基购自Hyclone公司; 优质胎牛血清购自GIBCO公司。FITC标记的抗人CD83（mAb）购自Serotec公司; FITC标记的抗人HLAⅡ mAb、 FITC标记的抗人CD86 mAb购自eBioscience公司; PE标记的抗人CD40 mAb购至Diclone公司。淋巴细胞分离液购自天津市川页生化制品有限公司; 乳酸脱氢酶试剂盒购自德国Roche公司。
1.2 方法
1.2.1 目的抗原RLD2的表达、 纯化及鉴定 参照[1]用经鉴定的重组质粒pTIGTrxA/RLD2转化感受态BL21（DE3）, 挑取阳性克隆, 接种于10mL LB培养基(含100mg/L氨卞青霉素)中, 37℃培养过夜。按1∶100比例将工程菌转接于500 mL新鲜的LB培养基中, 于37℃培养至A600约为05时, 加入终浓度为01 mmol/L的IPTG诱导表达, 于20℃培养9 h。表达产物用150 g/L SDSPAGE检测。取50 mL经诱导表达的工程菌, 于8℃ 10000 r/min离心10 min, 收集菌体, 用1×PBS洗涤2次后, 重悬于5 mL PBS缓冲液中, 液氮反复冻融3次, 于冰浴中超声破菌, 裂解产物于8℃ 10000 r/min离心15 min, 分别取上清组份与沉淀组份用于150 g/L SDSPAGE分析。然后将上清通过离子交换层析柱（DEAESepharose FastFlow）初步纯化去除硫氧化还原蛋白A（TrxA）, 再经镍离子亲和层析柱纯化得到目的蛋白RLD2。
1.2.2 目的抗原的糖基化修饰 参照文献[2]的方法取纯化的RLD2蛋白100 μg冷冻干燥后溶于20 μL水中, 于反应管中加入αD甘露吡喃异硫氰酸苯酯200 μg, 4甲基吗啉3 μL和二甲基亚砜200 μL, 室温反应过夜。然后加入TrisHCl（1 mol/L, pH9.5）100 μL, 室温下反应1 h, 得到甘露糖化的RLD2蛋白（mL2）。分别取mL2及未甘露糖化的RLD2（L2）, 用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDITOFMS)测定蛋白的相对分子质量（Mr）。
1.2.3 DC的制备及其表型变化的测定 取健康志愿者外周血20 mL, 加入等体积生理盐水稀释后混匀, 按2∶1的体积比将稀释后的血液缓慢加入含有淋巴细胞分离液的试管中, 保持界面。2000 r/min室温下离心20 min。吸取单个核细胞, 洗涤后加入含培养液的培养瓶, 37℃孵箱中贴壁2 h, 吸去悬浮细胞。在培养的贴壁细胞中加入rhGMCSF 和rhIL4（终浓度均为120 μg/L）, 于培养的第3天和第5天重新加入新鲜的细胞因子。在诱导的第5天, 将细胞分为3组, 其中1组为不加抗原的空白对照, 另两组分别加入L2和mL2（终浓度为0.15 nmol/L）, 37℃培养48 h。分别收集3组DC, 洗涤, 加入FITC标记的抗人CD83、 HLAⅡmAb及PE标记的抗人CD86 mAb各10 μL, 4℃孵育30 min。洗涤后固定, 流式细胞术检测DC表型的变化[3]。
1.2.4 T细胞的制备 取健康志愿者外周血20 mL, 分离PBMC, 在培养瓶中贴壁培养2 h后, 收获悬浮细胞作为效应细胞, 培养于含150 mL/L FCS的RPMI1640培养液中, 同时加入终浓度为5 μg/L IL2, 而贴壁细胞中加入rhGMCSF和rhIL4以诱导DC（方法同前）。
1.2.5 负载mL2或L2的DC诱导CTL特异性杀伤的检测 在DC诱导的第5天, 将未成熟的DC分为5组, 第1组为未用抗原诱导的空白对照, 第2～5组分别加入终浓度为0.03 nmol/L L2, 0.03 nmol/L mL2, 0.06 nmol/L L2, 0.06 nmol/L mL2。将5组细胞在37℃孵箱中培养16～24 h后, 各组DC以2.5×103/孔分别加入96孔U型板, 每组均设3个复孔。回收培养的悬浮细胞,调整细胞密度, 以5×104/孔加入上述含有DC的96孔U型板中, 在37℃孵箱中培养96 h 。将经DC刺激的效应细胞与靶细胞(SKBR3细胞)分别按5∶1、 10∶1和25∶1的比例加入96孔U型板中, 每孔含5×103个靶细胞, 终体积为200 μL /孔, 此时血清浓度为10 mL/L。应用试剂盒检测特异性靶细胞杀伤率。根据试剂盒说明书设立对照组, 包括只加入靶细胞的靶细胞自发释放组（SR靶细胞）、 只加入靶细胞并在检测前40 min加入10 mL/L Triton100的最大释放组（MR靶细胞）, 只加入效应细胞的效应细胞自发释放组（SR效应细胞）, 每组均设4个复孔, 在37℃孵箱中培养4 h。250 g离心10 min后, 每孔吸出50 μL上清, 转移至另一ELISA板, 每孔加入50 μL LDH反应液。室温避光放置30 min后, 测定492 nm的吸光度（A）值, 最后根据公式[（实验孔－ SR效应细胞－SR靶细胞）/（MR靶细胞－SR靶细胞）]×100 %杀伤百分数。实验重复3次, 对最后的结果进行统计学分析处理, 比较各组细胞杀伤率的差异。为检测针对HER2/neu的杀伤特异性, 我们还选取不表达HER2/neu的人乳腺癌细胞系MDA435细胞作为靶细胞, 进行对照, 观测受mL2致敏的效应细胞对其杀伤情况。
1.2.6 统计学处理 采用SAS医用统计软件包, 各组细胞杀伤率的组间差异检验采用χ2检验, P<0.05时有统计学意义。
2 结果
2.1 目的抗原的表达、 纯化及鉴定 采用本室构建的载体pTIGTrxA/RLD2, 转化大肠杆菌DL21（DE3）, 挑取阳性转化子诱导表达, 通过SDSPAGE分析表达产物。结果表明, 在Mr 17000和13000处各有一明显的条带, Mr 17000的蛋白与RLD2的预期分子量相符, Mr 13000的蛋白与TrxA预期的分子量位置相符。收集菌体超声裂解后, 取样进行SDSPAGE分析。结果显示（图1）, 第1泳道是诱导后全菌液, 第2泳道是诱导后全菌液经超声裂解后的上清, 第3泳道是包涵体裂解沉淀液, 第4泳道是经阴离子交换层析后纯化蛋白, 第5泳道是经镍离子亲和层析后纯化蛋白。根据电泳图可知, 在菌体蛋白中RLD2以可溶性和包涵体两种形式存在, 但以可溶性表达为主。超声裂解后的菌液上清经DEAESepharose FastFlow离子交换层析后, 去掉了主要的杂蛋白TrxA, 再经镍离子亲和层析除去其它的杂蛋白, 最终结果显示, 纯化的RLD2蛋白纯度达到85%。经蛋白浓度测定, RLD2蛋白的得率约为5 mg/L菌液。
图1 pTIGTrxA/RLD2表达产物的SDSPAGE分析（略）
Fig 1 Coexpression of TrxA and RLD2 analyzed by SDSPAGE
M: Protein marker; 1: pTIGTrxA/RLD2 plasmid induced by IPTG; 2: The supernatant of pTIGTrxA/RLD2 (induced by IPTG)cell lysate; 3: The pellet of GpTIGTrxA/RLD2 cellular lysate; 4: The protein purified by DEAESepharose FF column; 5: The protein purified by NiNTA agarose chromatography.
2.2 目的抗原的糖基化修饰 经MALDITOFMS检测分析, RLD2的Mr为16858, 与理论预测值相符（图2）。纯化后的蛋白纯度较高。RLD2蛋白的甘露糖修饰取决于αD甘露吡喃异硫氰酸苯酯与赖氨酸ε氨基共价结合, 质谱图中RLD2拟糖蛋白呈现多重峰（图3）, 这是由于重组蛋白中存在3个赖氨酸残基及体外糖基化反应的不均一性所致。体外糖基化反应分两步完成, 合成的RLD2拟糖蛋白是偶联1~3个基团的混合体系。
图2 RLD2蛋白的MALDITOFMS分析（略）
Fig 2 MALDITOFMS analysis of the purified RLD2 protein
图3 RLD2拟糖蛋白（mL2）的MALDITOFMS分析（略）
Fig 3 MALDITOFMS analysis of the RLD2 neoglycoprotein
2.3 受抗原致敏后DC免疫表型的变化 各组DC表面CD83、 HLAⅡ类分子、 CD86的表达情况见图4。未加抗原处理的DC几乎不表达CD83分子, 同时HLAⅡ类分子和CD86分子的表达水平也都较低, 表明在无外界抗原的刺激时, DC自发成熟的能力很弱。而用L2和mL2刺激的DC表面CD83、 CD86及HLA II类分子的表达水平显著增强, 提示L2和mL2均可促进DC成熟。但与L2蛋白相比, mL2刺激DC成熟的能力更强。
图4 流式细胞术分析不同抗原诱导后DC表型的变化（略）
Fig 4The expression of CD83, HLAII and CD86 on DC induced by different antigens
DC without antigen; DC pulsed with L2; DC pulsed with mL2.
2.4 负载mL2或L2的DC诱导的CTL特异性杀伤 各组效应细胞对肿瘤细胞SKBR3细胞的杀伤见图5。通过统计学分析, 在不同效靶比的条件下, mL2组及L2组的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤率均明显高于对照组(P<0.01)。负载不同浓度mL2的DC刺激效应细胞的杀伤率均明显高于L2组(P<0.01), 表明抗原的糖基化增强了DC的抗原提呈功能, 从而能更有效地刺激效应细胞的杀伤效应。同时, 各组效应细胞对肿瘤细胞MDA435（不表达HER2/neu）的杀伤见图6。统计分析结果显示: 在不同效靶比条件下, 负载不同浓度mL2的DC刺激的效应细胞的杀伤率与空白对照组相比无统计学意义(P>0.05), 由此可知, 受mL2致敏的效应细胞对不表达HER2/neu的MDA435没有特异性杀伤。
图5 不同DC诱导的T细胞特异性杀伤活性(SKBR3)（略）
Fig 5 Specific cytotoxicity of T cells induced by different DC(SKBR3)
图6 不同DC诱导的T细胞杀伤活性(MDA435)（略）
Fig 6 Cytotoxicity of T cells induced by different DC(MDA435)
3 讨论
HER2/neu蛋白由胞外区结构域、 跨膜结构域和胞内区结构域3部分组成。胞外区结构域包括2个配体结合区（RLD1和RLD2）和2个富含半胱氨酸区。RLD1由第52～185位氨基酸组成, RLD2由第377～497位氨基酸组成[4], 两个RLD区之间有一个富含半胱氨酸区[5]。经机软件预测, 在HER2/neu RLD2中存在多种免疫表位, 能结合多数MHC分子。与小分子的肽抗原相比, RLD2蛋白的Mr大, 含有大量的已知或未知表位。并且, 将RLD2与硫氧化还原蛋白偶联, 可以实现目的蛋白的高效可溶性表达。因此, 以HER2/neu RLD2蛋白为靶标设计肿瘤疫苗, 具有较多的优越性[6]。甘露糖受体（mannose receptor, MR）是DC所特有的膜表面受体, 它可快速循环于胞膜和早期内体（early endosome）间, 在较短的时间内即可内化大量的抗原[7] 。基于MR可有效介导肿瘤抗原的摄取及内化, 我们将 RLD2蛋白在体外进行甘露糖修饰, 使糖基化的目的抗原含有DC表面MR的特异性配基, 通过甘露糖受体介导的内化作用, 使糖基化抗原较之未糖基化抗原能更有效地被DC摄取及提呈, 并调动机体主动特异性抗肿瘤免疫功能, 诱导更有效的T细胞应答[8]。在实验中我们发现, 目的蛋白糖基化修饰后能更有效地诱导DC成熟,使其表达更高水平的CD83、 CD86、 HLA II类分子。本研究结果表明, 糖基化抗原较之未修饰抗原可促进DC的成熟, 而DC的成熟状态将极大地影响免疫应答的诱导及类型[9]。另外, 糖基化抗原致敏的DC能使效应细胞更好地杀伤高表达HER2/neu的SKBR3细胞, 这提示糖基化抗原通过DC表面MR的介导, 提高抗原摄取的效能, 促进DC成熟及抗原提呈, 进而诱导出更多的抗原特异性CTL, 产生更有效的杀伤肿瘤细胞的效应。通过实验我们认为, 对肿瘤抗原进行糖基化修饰, 很有可能成为提高抗肿瘤免疫效果的有效策略。不过, 对于肿瘤抗原靶标的选择, 糖基化抗原在促进DC成熟以及增强抗原提呈中所涉及的分子机制, 以及现有体外实验结果能否在体内重复等, 仍是目前研究的关键。
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