新型重组免疫毒素DT390
作者：贾怡, 李虹, 陈文捷, 吕梅励, 李明远, 蒋忠华, 张林
【关键词】 实验性变态性脑脊髓炎;,DT390;,mRantes;,重组免疫毒素
Primary study of the recombinant immunotoxin DT390mRantes in EAE therapy
[Abstract] AIM: To construct a novel eukaryotic expression plasmid including the recombinant immunotoxin DT390mRantes and treat experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice. METHODS: EAE in C57BL/6 mice were induced by the extracted MBP. The mRantes fragment was inserted into the eukaryotic expression plasmid SRα containing DT390. Then cationic liposomeembedded plasmid DNA was injected into the muscles of the hindlimbs in mice. The effect of DT390mRantes was evaluated by observing clinical symptoms, pathological changes of brain, relative cytokine of peripheral blood, and the proportion of T cells and B cells. RESULTS: The recombinant immunotoxin DT390mRantes was successfully constructed. Compared the mice in treated group with those in untreated group the clinical symptoms of EAE were alleviated, the infiltration of inflammatory cells were decreased, the IFNγ level was fallen, and the ratio of T/B cells was decreased. CONCLUSION: The recombinant immunotoxin DT390mRantes has distinct effects on EAE in mice, which may be used for beneficial reference to the therapy of MS.
[Keywords]experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE); DT390; mRantes; recombinant immunotoxin
[摘 要] 目的: 构建一种含有重组免疫毒素DT390mRantes（白喉杆菌外毒素390片段活化T细胞表达与分泌调节因子）的真核表达质粒, 并用于小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。方法: 利用自提的MBP诱导C57BL/6小鼠产生EAE, 将mRantes导入含有DT390的真核表达质粒SRα中, 经阳离子纳米脂质体包被后, 治疗小鼠EAE, 同时对其临床症状、 脑部病理改变、 外周血相关细胞因子及T/B细胞比例进行检测, 了解该重组免疫毒素的治疗效果。结果: 成功构建真核表达质粒DT390mRantesSRα, 治疗组小鼠临床症状减轻, 脑部特异性淋巴细胞浸润减少, 外周T细胞相关细胞因子表达降低, T/B细胞比例降低。结论: 新型重组免疫毒素DT390mRantes治疗小鼠EAE有较为明显的效果, 为治疗人的多发性硬化（MS）提供有益的借鉴。
[关键词]实验性变态性脑脊髓炎; DT390; mRantes; 重组免疫毒素
人的多发性硬化（multiple sclerosis, MS）是一种难以治愈的以中枢神经系统脱髓鞘病变为主要特征的自身免疫性疾病。实验性动物自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）, 又称为实验性变态反应性脑脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis）与MS在临床表现、 生化指标及病理等方面均具有很多相同之处, 常被作为MS的理想动物模型[1]。在EAE中, T细胞被自身抗原如髓鞘素碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）[2]、 蛋白脂蛋白（proteolipid protein, PLP）[3]、 少突胶质细胞糖蛋白（myelin oigodendrocyte glycoprotein, MOG）[4]、 髓鞘素结合糖蛋白（MAG）等活化而进入中枢神经系统产生炎性反应。本实验中将活化T细胞表面受体CCR5的配体Rantes （regulated on activation normal T cells expressed and secreted）[5]与修饰的白喉杆菌外毒素DT390相连, 构建一种新型的重组免疫毒素核酸制剂DT390mRantes。用其定向杀伤活化的自身反应性T细胞, 并检测该重组免疫毒素对EAE的治疗作用。
1 材料和方法
1.1 材料 C57BL/6雌性小鼠48只, 6~8 周龄, 质量13~18 g, 购自四川大学华西实验动物中心。新鲜牛脊髓, 福氏完全佐剂（FCA, 内含结核分枝杆菌5 g/L）为四川大学基础医学与法医学院免疫学教研室馈赠。灭活的百日咳杆菌菌液[内含百日咳杆菌（3～9）×109/L]为成都市生物制品研究所产品。真核表达质粒SRα（内含DT390片段）为美国Wisconsin大学胡怀忠教授提供。RTPCR试剂盒为Tarkara公司产品。限制性内切酶Nco I、 EcoR I、 Sal I、 T4连接酶为New England公司产品。质粒大抽试剂盒为Qiagen公司产品。IFNγ ELISA 检测试剂盒为R&D公司产品。兔抗鼠CCR5单克隆抗体(mAb)为博士德公司产品。抗鼠CD19PE、 抗鼠CD3FITC为BD Pharmingen公司产品。流式细胞仪（Epics Elite ESP）为Beckman Coulter 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 MBP粗提物的提取与鉴定 参照Kies法[6]加以改进从新鲜牛脊髓中提取MBP粗提物, 在UV260紫外分光光度计上测定粗提物的吸光度A260和A280值。 根据公式: 蛋白质浓度（g/L）=（1.45A280－0.74A260）× 稀释倍数, 出蛋白浓度。利用SDSPAGE电泳检测蛋白的浓度和纯度。
1.2.2 重组免疫毒素真核表达质粒的构建 使用Trizol试剂从小鼠肝组织中提取出总RNA。RTPCR的方法参照TaKaRa公司试剂盒（二步法）说明书进行。为了便于克隆和表达, 在mRantes基因PCR特异性的引物两端分别加入了Nco I和EcoR I的酶切位点和相应的保护碱基, 上游: 5′CAT GCC ATG GGC CTC ACC ATA TGG CTC GGA C3′, 下游: 5′CCG GAA TTC CTA GCT CAT CTC CAA ATA GTT3′, PCR扩增产物使用10 g/L琼脂糖电泳分离。将mRantes基因片段插入到含有DT390的真核质粒SRα中, 构建成一种新的真核表达质粒DT390mRantesSRα。利用限制型内切酶Nco I, EcoR I及Sal I酶切图谱分析重组质粒, 酶切产物使用10 g/L琼脂糖电泳分析, 同时进行DNA序列分析（上海博亚生物技术公司完成）。
1.2.3 真核表达质粒的包被 大量抽提DT390mRantesSRα真核表达质粒, 参照Qiagen公司endofree plasmid maxi试剂盒操作手册, 并用阳离子纳米脂质体将其包被形成DNA阳离子脂质体复合物[7]。
1.2.4 EAE动物模型的建立及治疗 将C57BL/6小鼠48只随机分成2组, 其中8只为阴性对照组, 40只为实验组。将自提的MBP粗提物与FCA（内含结核分枝杆菌5 g/L）等体积混和制成油包水的乳剂, 实验组小鼠每只腹腔注射该混和液0.2 mL, 百日咳杆菌菌液∶PBS（1∶50）混和液0.2 mL[内含百日咳杆菌（0.6～1.8）×106个]; 初次免疫后第7天加强免疫1次, 方法及剂量与第1次相同。将鉴定正确的真核表达质粒DT390mRantesSRα转化感受态大肠杆菌JM109, 挑取单克隆菌落扩大培养, 然后进行质粒大量抽提, 方法参照Qiagen公司endofree plasmid maxi试剂盒操作手册。将40只实验组小鼠随机平分为2组, 即治疗组与未治疗组。治疗组小鼠经后腿肌肉注射DNA阳离子脂质体复合物50 μg/只/次（溶于50 μL PBS）中, 未治疗组小鼠后腿注射PBS 50 μL（10 mmol/L pH7.4）, 初次免疫后第1天与第3天进行2次治疗, 方法与剂量同上。
1.2.5 小鼠临床症状的观察 从初次免疫起, 每天观察小鼠的临床症状。参照Kono的分级方法[8]将症状分为6级: 0级, 没有任何临床症状; 1级: 动物尾部乏力; 2级: 动物尾部乏力＋前肢或后肢中等乏力; 3级: 前肢或后肢严重乏力, 人为翻身后不能恢复; 4级: 肢体麻痹, 人为翻身后不能恢复; 5级: 濒死状态。根据其症状进行评分。
1.2.6 小鼠脑部病理改变的观察 每隔3 d取实验组和对照组小鼠, 20 g/L戊巴比妥那0.2 mL将小鼠麻醉后, 用40 g/L多聚甲醛进行心脏灌注, 解剖取出其大脑、 小脑、 延脑及脊髓。使用CCR5 mAb经免疫组织化学染色, 镜下观察病理改变。
1.2.7 小鼠外周血血清中IFNγ含量的检测 每隔3 d取小鼠眼球血, 分离血清, 操作按照R&D公司的ELISA试剂盒操作手册, 检测外周血中IFNγ水平的变化情况。
1.2.8 小鼠外周血中T、 B细胞的检测 每隔3 d将小鼠处死后, 无菌取小鼠脾脏, 制成脾细胞悬液, 使用小鼠淋巴细胞分离液分离得到单个核细胞; 置于含有PMA, Monensin及Ionomycin的含有100 mL/L胎牛血清 RPMI1640培养液中, 37℃ 50 mL/L CO2 孵育过夜; 收集细胞, 加入FITC标记的CD3 mAb及PE标记的CD19 mAb室温避光孵育20 min; 洗涤3次后, PBS（10 mmol/L pH7.4）重悬, 使用流式细胞仪检测T淋巴细胞/B淋巴细胞的比例。
2 结果
2.1 蛋白粗提物相对分子质量（Mr）和浓度 MBP蛋白粗提物SDSPAGE电泳的结果见图1, 片段Mr约为17000。测得蛋白粗提物的吸光度A260=0.123和A280=0.155, 根据公式其蛋白浓度为1.3373 g/L。
图1 MBP粗提物SDSPAGE电泳结果（略）
Fig 1 Electrophoresis results of MBP
1, 3: Protein marker; 2: Extracted MBP.
2.2 真核表达质粒DT390mRantesSRα的构建 经过RTPCR, 得到了小鼠特异性的mRantes基因片段, 大小约为210 bp, 将mRantes基因片段插入真核质粒SRα特定位置, 构建成真核表达质粒DT390mRantesSRα。图2为EcoR I、 Sal I、 Nco I酶切鉴定的结果, 使用EcoR I单酶切, 片段长度约为85 kb; EcoR I及Sal I双酶切, 2条片段长度分别约为7 kb及1.5 kb; 将双酶切后的小片段用Nco I酶切后, 结果又将该片段切割成为约200 bp及1.3 kb左右的片段(图2)。DNA测序结果显示, 插入mRantes片段后, 真核质粒的阅读框架保持不变, 且小鼠mRantes及DT390序列与基因库公布的符合（测序结果未显示）。
图2 利用限制型内切酶分析重组质粒DT390mRantesSRα（略）
Fig 2 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid DT390mRantesSRα
1: DNA marker(1 kb plus); 2: DT390mRantesSRα EcoR I; 3: DT390mRantesSRα EcoR I+Sal I; 4: DT390mRantes fragment of gel extraction; 5: DT390mRantes fragment NcoⅠ.
2.3 EAE小鼠临床症状的变化 初次免疫后第6天开始, 未组小鼠开始出现EAE症状, 包括行动缓慢, 后肢外展, 拖尾等, 在第15~20天, 症状达到高峰, 出现体质量减轻, 后肢瘫痪等, 高峰期的临床评分为2.17±0.17, 从第21天症状开始减轻, 第35天左右恢复正常; 治疗组小鼠平均第14天才开始发病, 疾病周期持续约20 d, 高峰期的临床评分为1.17±0.29 (P<0.05, 图3）。
图3 实验组与对照组小鼠临床评分（略）
Fig 3 The mean cliniacal scores of different groups
2.4 EAE小鼠脑部病及免疫组织化学检测结果 临床症状高峰期的未治疗组小鼠脑膜周围有大量炎性细胞浸润, 整片发现, 大脑皮质疏松, 小脑脑膜下淋巴细胞浸润, 脑膜血管周围淋巴细胞浸润等病理改变; 而治疗组小鼠脑膜血管周及大脑实质中淋巴细胞浸润明显减少, 未发现明显的病理改变; 使用抗小鼠的CCR5 mAb作为一抗进行免疫组织化学检测, 未治疗组小鼠症状高峰期发现, CCR5阳性细胞可存在于白质、 灰质及软脑膜等, 其中脑膜血管周部分最多, 同期治疗组小鼠CCR5阳性细胞很少, 在该组小鼠症状高峰期检测发现, CCR5阳性细胞仍然很少（图4）。
图4 中枢神经系统中CCR5+ T细胞免疫组织化学结果（略）
Fig 4 Immunohistochemical detection of CXCR5+ T cells in the CNS (×40)
A: The meningeal perivascular situation of treated mice; B: The cerebral situation of treated mice; C: The meningeal perivascular situation of untreated mice; D: The cerebral situation of untreated mice; E: The meningeal perivascular situation of normal mice; F: The cerebral situation of normal mice.
2.5 外周血细胞因子检测结果 治疗组外周血IFNγ的峰值为（45.47±2.35）ng/L, 低于PBS组的（337.70±33.57）ng/L（P<0.05）, 且治疗组高峰出现的时间较未治疗组晚约10 d（图5）。
2.6 DT390mRantes对T淋巴细胞的作用 流式细胞术检测结果发现, 治疗组中小鼠高峰期CD3+ T细胞的比例为(14.1±1.35)%, 未治疗组中为(24.93±2.14)%, 阴性对照组为(12.49±1.32)%; 而治疗组中小鼠高峰期CD19＋ B细胞的比例为(68.27±7.19)%, 未治疗组中为(61.57±4.54)%, 阴性对照组为(70.87±5.06)%（图6）。
图5 各组小鼠外周血IFNγ水平变化情况（略）
Fig 5 The IFNγ level in peripheral blood of different groups
图6 各组T细胞与B细胞的比例（略）
Fig 6 The proportion of T cells and B cells in different groups
A: DT390mRantes treated group; B: Untreated group; C: Normal group.
3 讨论
EAE是由T细胞介导的自身免疫性疾病, 它的发生是一个非常复杂的过程, 体内的神经内分泌免疫系统会发生一系列的变化[9]。目前认为小鼠EAE产生是由活化的自身免疫性T细胞由局部淋巴组织迁移到中枢神经系统, 造成CNS炎性损害的结果, 其中趋化因子及其受体之间的相互作用在T细胞迁移过程中发挥了重要的作用。研究表明, 在活化T细胞表面表达有一些特异性的受体, 如CCR5[10]、 CXCR3、 IL2R等, 而未活化的T细胞表面不表达这些受体。本实验中, 将活化T细胞上CCR5受体的配体Rantes与修饰过的白喉杆菌外毒素DT390组成一种重组免疫毒素, 通过CCR5与Rantes之间的作用, DT390mRantes与CCR5+的T细胞发生特异性结合, 并通过内吞的方式进入胞内。DT390在胞内发挥其抑制细胞内蛋白合成的作用, 最终杀死细胞, 以此治疗EAE疾病。为了使mRantes基因片段正确地插入到真核质粒的指定位置, 设计mRantes基因的引物时, 在其PCR特异性的引物两端分别加入了Nco I和EcoR I的酶切位点和相应的保护碱基, 同时使用这2个酶切真核质粒SRα, 然后进行连接反应, 成功地形成了DT390mRantes的重组免疫毒素片段。从而有利于相应的DT390mRantes融合蛋白的表达。通常, 利用重组免疫毒素治疗的方法首先是将重组免疫毒素在细菌或酵母菌中体外表达, 然后经浓缩和纯化后使用[11]。本实验中, 将含有重组免疫毒素核酸片段的真核表达质粒用阳离子脂质体进行包被后形成DNA脂质体复合物直接使用, 简化了实验步骤, 同时由于包被后形成的DNA脂质体复合物具有保护DNA和缓释的作用, 使得目的DNA可以缓慢释放, 在体内翻译成为目的蛋白, 延长了作用时间。通过对治疗组与未治疗组小鼠临床症状的观察评分、 脑部病理切片的检查、 外周血IFNγ的水平的变化、 和T/B细胞的比率变化, 说明一种新型重组免疫毒素DT390mRantes真核表达载体被构建成功, 同时它可以延缓小鼠EAE的发生, 减轻疾病的强度, 有效地抑制活化的T细胞, 对其具有较强的杀伤能力。本研究为治疗人的MS提供了一些有益的借鉴, 其中包括靶向分子的选择、 新型重组免疫毒素的构建及常用的治疗方法等。目前需要进一步研究的内容包括重组免疫毒素体内毒性的检测, 及其在体内各脏器的代谢情况等。只有对该重组免疫毒素特性的进行深入研究, 才能为人MS的治疗提供更详尽的资料, 为MS的治疗提供新的方法。
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