嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫应答及其保护力
作者：杨志伟, 陈建平，王涛, 田玉
【关键词】 嗜肺军团菌;,免疫原蛋白;,免疫原性;,DNA疫苗
Immune response and protective efficacy in BALB/c mice induced by DNA vaccine encoding immunogenic protein of Legionella pneumophila
[Abstract] AIM: To study the immune response in mice induced by DNA vaccine encoding immunogenic protein of Lgeionella pneumophila (LP) and to examine its protective efficacy against LP in mice. METHODS: The eukaryotic expression recombinant plasmid of LP immunogenic protein gene ( pcDNA3.1ip) was constructed and used to immunize BALB/c female mice intramuscularly, and antigen specific antibodies, lymphocyte proliferative response, IFNγ production and cytotoxic Tlymphocyte response of the immunized mice were detected. The BALB/c mice immunized by the pcDNA3.1ip repeatedly were then challenged with LP (10 LD50), and the number of survivors in each group was quantitated. Then the mice were sacrificed and lung tissue were harvested for quantitative culture of LP and observation of the pathologic changes. RESULTS: The DNA vaccine pcDNA3.1ip could induce specific humoral and cellular immunity in the immunized mice. The results indicated that the immunogenicity of pcDNA3.1ip was higher than that of pcDNA31(+) (P<001). The vaccine was effective in protecting mice against infection after LP (10LD50) challenge. CONCLUSION: The DNA vaccine encoding immunogenic protein of LP can be used as a candidate for novel vaccine design.
[Keywords]Legionella pneumophila; immunogenic protein; immunogenicity; DNA vaccine
[摘 要] 目的: 研究嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗诱导的小鼠免疫原性以及对LP感染小鼠的保护能力。方法: 用嗜肺军团菌免疫原蛋白基因真核表达重组质粒pcDNA31ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠, 检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、 脾淋巴细胞增殖活性、 IFNγ产生水平和CTL特异杀伤活性等指标, 以评价疫苗的免疫原性。真核表达重组质粒pcDNA31ip DNA疫苗重复免疫BALB/c小鼠2次, 末次免疫2周后, 用10倍LD50剂量攻击小鼠, 计数小鼠的存活数及小鼠肺中的细菌数, 观察感染鼠的肺部病理变化。结果: pcDNA31ip免疫小鼠后诱导产生了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答, 免疫组的免疫原性和免疫保护性均高于对照组pcDNA31(+)组（P<001）。结论: 免疫原蛋白基因可作为嗜肺军团菌核酸疫苗的侯选基因。
[关键词]嗜肺军团菌; 免疫原蛋白; 免疫原性; DNA疫苗
军团病是近30年来新发现的传染病之一。军团病是由军团菌引起的一种以肺炎为表现的常伴多系统损害的急性细菌性传染病, 病程进展快, 病死率高, 易爆发流行。其中引起人类疾病的主要是嗜肺军团菌（Legionella pneumophila, Lp）, 有15个血清型, 其中以血清Ⅰ型最为重要。军团菌广泛存在于环境水和供水系统中, 人因吸入含有军团菌的气溶胶而感染, 并在肺泡上皮细胞和单核巨噬细胞内增殖。该病目前尚无有效的疫苗用于预防。军团菌的外膜蛋白与其致病密切相关。相对分子质量（Mr）为2900的外膜蛋白（29 kD immunogenic protein, IP）为1～10血清型所共有, 具有种的特异性, 是机体免疫应答反应的主要免疫原, 由嗜肺军团菌主要免疫原基因ip编码产生[1]。Mr2900外膜蛋白也与细菌的毒力密切相关, 具有黏附作用、 抗吞噬作用等。我们将已构建好的嗜肺军团菌ip基因真核重组质粒pcDNA31ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠, 观察其免疫原性和免疫保护性。
1 材料和方法
1.1 材料 嗜肺军团菌菌株Lp1型标准株及军团菌兔抗血清由疾病预防控制中心传染病控制所惠赠, 本室保存。质粒pcDNA31(+)由本室保存, 重组质粒pcDNA31ip由作者在以往的研究中构建。Omega无内毒素质粒大提取试剂盒购自天泰试剂公司, BPB Biomedicals.Inc(USA)小鼠IFNγ检测试剂盒购自豪亿试剂公司, 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体及其他试剂均购自博瑞克试剂公司。BALB/c 小鼠, 雌性, 6~8周龄, 质量18 g左右, 由四川大学华西实验动物中心提供。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫 大量抽取无内毒素质粒pcDNA31(+)和重组质粒pcDNA31ip, 在紫外分光光度计上测量吸收值, DNA含量并分析其纯度。BALB/c雌性小鼠18只, 随机分为2组, 每组9只。每只小鼠股四头肌肌肉注射质粒DNA进行免疫接种。第1组每只小鼠注射pcDNA31ip 50 μg, 第2组每只小鼠注射pcDNA31(+) 50 μg作为对照组。各组在初次免疫2周后用相同剂量的质粒加强免疫1次。加强免疫后第7、 14、 21天, 每组分别取3只小鼠, 眼部采血, 分离血清测抗体、 IFNγ; 无菌取脾脏, 分离淋巴细胞, 记数并调整细胞密度为2×109/L备用。
1.2.2 检测小鼠体内特异性抗体 用无菌PBS洗下BCYEα琼脂培养基上生长良好的嗜肺军团菌Lp1型菌落, 充分混匀, 离心洗涤2次, PBS重悬。超声波粉碎10 min, 4000 r/min离心10 min, 取上清, 即为制备的混合抗原。用包被缓冲液将抗原稀释至最佳工作浓度, 包被酶标板。用间接ELISA法测定血清中抗体水平。
1.2.3 检测细胞免疫效应 （1）3HTdR 掺入法检测淋巴细胞增殖活性: 取制备好的小鼠脾淋巴细胞悬液1 mL, 接种12孔细胞培养板, 每只小鼠脾细胞各接种3个复孔, 分别加入ConA（终浓度为10 mg/L）, 并设对照孔（不加ConA）。37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养56 h, 每孔加入2 μCi 3HTdR, 继续培养16 h。在β液闪记数仪上测定cpm值。计算刺激指数（SI）作为淋巴细胞增殖程度的指标。SI=（实验孔cpm值－机器本底）/（对照孔cpm值－机器本底）。（2）CTL杀伤活性检测: 以质粒pcDNA31ip转染并筛选出的阳性细胞克隆作为检测CTL杀伤活性的靶细胞。取小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞。用完全培养液调整效应细胞与靶细胞的浓度, 使其细胞数之比为10∶1, 两种细胞各取50 μL加至同一孔中, 并设效应细胞、 靶细胞对照孔及空白对照孔。37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养20 h, 每孔加15 μL MTT继续培养4 h, 培养板以2000 r/min离心5 min, 弃培养液, 加100 μL二甲基亚砜, 37℃孵育30 min, 测量A570值, 计算杀伤活性。CTL杀伤活性=[1－（实验孔A570－对照效应细胞A570）/对照靶细胞A570]×100%。
1.2.4 检测细胞因子IFNγ 用双抗体夹心ELISA检测血清中IFNγ含量, 按照说明书操作步骤进行。
1.2.5 免疫保护作用 选6～8周龄的BALB/c雌性健康小鼠, 随机分为4组, 每组5只。每只小鼠股四头肌肌肉注射质粒DNA进行免疫接种。A组每只小鼠注射重组质粒pcDNA31ip 50 μg; B组每只小鼠注射质粒pcDNA31（+） 50 μg作为阴性对照; C组每只小鼠注射50 μL PBS作为空白对照; D组每只小鼠注射50 μL PBS作为正常对照; 相同剂量相同途径免疫2次, 间隔2周, 各组在末次免疫2周后用10×LD50嗜肺军团菌L1型标准株攻击A、 B、 C组小鼠。
1.2.6 嗜肺军团菌L1型标准株的培养 复苏保种的嗜肺军团菌L1菌株, 划线接种于固体培养基, 放置在35℃烛缸培养约5 d, 挑取单个菌落接种涂布多个培养基, 继续放置在35℃烛缸培养约5 d, 用无菌生理盐水洗下平板上的菌落, 放置在旋涡混匀器上充分混匀, 使其形成菌悬液。用比浊管计算细菌密度, 调整为15×1013/L。每只小鼠滴鼻200 μL嗜肺军团菌L1菌液进行攻击, 观察小鼠行为变化。
1.2.7 检测动物免疫保护效果 （1）检测肺组织培养带菌量: 空白对照组小鼠全部死亡后, 其余小鼠断颈处死。将死亡与断颈处死的小鼠置750 mL/L酒精消毒后, 在无菌条件下解剖取出右肺, 加入2 mL无菌生理盐水, 用眼科剪剪碎肺组织, 移至200目无菌不锈钢网中研磨充分匀浆, 取肺组织匀浆液的原液连续10倍稀释, 各取100 μL, 均匀铺于固体培养基表面, 放置在35℃烛缸培养约7 d, 挑取平板上长出的菌落涂片, 进行革兰染色, 在显微镜下观察, 并用血清凝集实验确证其为嗜肺军团菌后进行菌落计数。根据每块平板上长出的菌落数计算出小鼠肺组织培养的总带菌量（CFU值）, 对各免疫组数值进行统计学分析。（2）肺组织病理形态学检测: 空白对照组小鼠全部死亡后, 其余的小鼠断颈处死。每组取小鼠无菌操作, 分离肺组织。首先肉眼观察其形态变化, 然后取每只小鼠左肺上叶, 用4 g/L多聚甲醛固定、 石蜡包埋切片、 HE染色后, 在显微镜下观察小鼠肺组织病理形态学改变。
1.2.8 统计学处理 组间差异比较采用单因素方差分析, P<005为具有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠体内抗原特异性抗体的滴度 在加强免疫后第7、 14、 21 天, 实验组检测到抗体, 第7天的滴度为1∶1280; 第14、 21天的最高滴度可达到1∶2560。而空质粒对照组未检测到抗体。实验组与空质粒对照组比较有显著性差异（P<001）。
2.2 细胞免疫水平检测 检测淋巴细胞增殖活性、 血清中IFNγ水平、 CTL杀伤活性等细胞免疫反应的指标显示: 加强免疫后第7、 14、 21天, pcDNA31ip免疫组淋巴细胞增殖活性、 血清中IFNγ、 CTL杀伤活性均高于pcDNA31(+)对照组, 差异均有统计学意义（P<001）（表1-3）。
表1 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖活性（略）
Tab 1 The proliferative response of spleen derived lymphocytes from mice immunized with DNA vaccine against Legionella pneumophila
bP<0.01 vs pcDNA3.1(+) immunized group.
表2 免疫小鼠血清中IFNγ水平（略）
Tab 2 IFNγ level in production derived serum of mice immunized with DNA vaccine against Legionella pneumophila
bP<0.01 vs pcDNA3.1(+) immunized group.
表3 免疫小鼠脾脏CTL杀伤活性（略）
Tab 3 Cytotoxicity of spleen derived lymphocytes from mice immunized with DNA vaccine against Legionella pneumophila
bP<0.01 vs pcDNA3.1(+) immunized group.
2.3 免疫保护作用 嗜肺军团菌L1菌液攻击1 d 后, 阴性对照、 空白对照组小鼠均出现立毛、 食欲降低、 活动迟缓, 6 d后全部死亡。pcDNA31ip免疫组在攻击2 d 后, 才出现症状, 4 d后开始恢复, 仅有1只小鼠死亡。肺组织培养的菌落计数, 根据每个平板上长出的菌落数出小鼠肺组织培养的总带菌量(CFU值)。免疫组带菌量均明显低于pcDNA31(+)质粒对照组(P<001); 小鼠存活率明显高于对照组（表4）。小鼠肺组织HE染色后镜检: 主要表现为炎性病变; 镜下可见肺泡隔明显增宽, 局部毛细血管扩张充血, 并可见中性粒细胞及单核浸润, 肺泡腔内可见渗出物。与pcDNA3.1ip免疫组小鼠相比, 阴性对照组的小鼠肺部病变明显严重（图1）。
表4 免疫保护作用（略）
Tab 4 Protective immunity to lethal dose challenge with Legionella pneumophila
bP<0.01 vs pcDNA3.1(+) immunized group.
图1 LP1感染BALB/c小鼠肺组织病改变（略）
Fig 1 The histopathology of lung of mice challenged with a lethal dose of L.pneumophila (HE, ×200)
A: Shaminfected lung; B: pcDNA3.1ip immunized lung on the sixth day after the challenge; C: pcDNA3.1(+) immunized lung on the sixth day after the challenge. The sections were stained with hematoxylin and eosin. Note interstitial infiltration of inflammatory cells. Shaminfected mice did not show any changes.
3 讨论
军团菌疫苗的研究, 已有近20年, 经历了死疫苗、 减毒活疫苗、 蛋白亚单位疫苗。但都因其各自的不足难以在临床推广应用。死疫苗常需要多次接种, 剂量较大, 接种后局部和全身反应较明显, 通常只激发体液免疫。减毒活疫苗有潜在的危险性。蛋白亚单位疫苗只能刺激体液免疫。Yoon 等[2]首次以嗜肺军团菌肽聚糖关联的脂蛋白（PAL）基因构建重组质粒pcDNA31pal作为疫苗, 并比较了其与重组PAL蛋白免疫BALB/c小鼠后的免疫原性, 结果显示, 重组PAL蛋白主要诱生PAL体液免疫而重组质粒pcDNA31pal则能有效诱导细胞免疫。本课题组王涛等已完成的以嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强蛋白基因（macrophage infectivity potentiator）Mip为候选基因, 初步研究证实, Mip基因DNA疫苗具有较强的免疫原性[3]。军团菌是一种兼性胞内寄生菌, 主要以细胞免疫为主。DNA 疫苗通过肌肉注射, 能在肌细胞中获得持久的抗原表达, 该抗原能诱导抗体产生、 T细胞增殖和细胞因子释放, 尤其是能诱导细胞毒性T细胞的杀伤作用[4, 5]。被誉为第3次疫苗革命的核酸疫苗的出现, 为军团菌疫苗的研制提供了新思路。 机体抗嗜肺军团菌的免疫应答依赖于T细胞直接杀伤作用及其分泌细胞因子的协助。针对嗜肺军团菌细胞免疫应答是以T细胞为介导、 以巨噬细胞为效应细胞的免疫反应。有效的抗嗜肺军团菌免疫应答包括: 巨噬细胞的吞噬作用以及处理与提呈抗原, T细胞对抗原特异性识别与结合, 以及释放细胞因子, 激活巨噬细胞, 对细菌杀伤。用嗜肺军团菌的细菌细胞膜免疫动物, 具有明显的保护力, 说明细菌细胞膜里含有保护作用的分子[6]。Mr2900蛋白是嗜肺军团菌的主要外膜蛋白, 也是嗜肺军团菌含量最多的蛋白, 广泛分布与细菌的内、 外细胞膜及其胞质中[7]。嗜肺军团菌血清1型(Mr2900)蛋白的单克隆抗体能与嗜肺军团菌1-10血清型菌细胞发生反应, 其阳性率为100%, 与米克戴德军团菌、 约旦军团菌、 瓦茨沃斯军团菌、 伯明翰军团菌、 长滩军团菌均不发生反应, 与肺炎链球菌、 流感嗜血杆菌也不发生反应。1-10血清型Lp均有Mr2900外膜蛋白的存在, 具有种的特异性[8]。Weeratna等[9]用主要外膜蛋白分别刺激嗜肺军团菌感染者与健康志愿者的外周淋巴细胞, 研究发现主要外膜蛋白能明显刺激嗜肺军团菌感染者的外周淋巴细胞增殖, 而对健康志愿者的外周淋巴细胞无作用; 用25倍的LD50嗜肺军团菌分别攻击主要外膜蛋白免疫的豚鼠与正常豚鼠, 正常豚鼠全部死亡, 而免疫的豚鼠无死亡。但未做有关Mr2900外膜蛋白基因构建成DNA疫苗的免疫原性及免疫保护性研究。为此本研究中选用嗜肺军团菌的Mr2900外膜蛋白作为候选基因, 构建pcDNA31ip DNA疫苗, 开展嗜肺军团菌免疫原蛋白核酸疫苗保护性研究。我们将pcDNA31ip作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠, 检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、 脾淋巴细胞增殖活性、 血清中IFNγ水平、 CTL杀伤活性等指标, 表明DNA疫苗诱导小鼠产生了特异性体液和细胞免疫应答。血清中IFNγ水平增加有利于巨噬细胞的激活, 以及对细菌的杀伤。用10倍的LD50嗜肺军团菌分别攻击主要外膜蛋白免疫的小鼠、 阴性与空白对照, 阴性与空白对照小鼠全部死亡, 而免疫组死亡1只小鼠, 表明我们构建的pcDNA31ip DNA疫苗能诱导小鼠产生较好的免疫保护性。该结果证实免疫原蛋白基因可作为嗜肺军团菌核酸疫苗后选基因, 从而为ip基因DNA疫苗的研制提供了初步的实验依据。
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