经鼻黏膜给予MBP68

                 作者：孙博, 杨硕, 彭海生, 乔慧, 曹京燕, 金连弘, 李呼伦

【关键词】  鼻黏膜耐受;,MBP68

　　　　[Abstract]  AIM: To explore the synergistic effect of MBP6886 and 8799, on the inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in Lewis rat by nasal administration. METHODS: Three different MBP peptides(MBP6886, 8799, and the nonencephalitogenic peptide 110128) were synthesized and administrated nasally to Lewis rat on day11, 10, 9, 8 and 7 prior to immunization with the guinea pig MBP (gpMBP) + CFA, which was used to induce EAE. The protective effect on Lewis rat from EAE by the MBP peptides was evaluated. RESULTS: Protection was achieved with the encephalitogenic peptides MBP6886 and 8799, MBP6886 being more potent, but not with MBP110128. Neither MBP6886 nor 8799 used alone conferred complete protection to gpMBPinduced EAE. In contrast, nasal administration of a mixture of MBP6886 and 8799 completely blocked gpMBPinduced EAE even at lower dosage than being used alone. Rats tolerized with MBP6886+8799 nasally showed decreased T cell responses to MBP, reflected by lymphocyte proliferation and IFNγ ELISPOT assays. Rats tolerized with MBP6886+8799 also had abrogated MBPreactive IFNγ and TNFα mRNA expression in lymph node cells compared to rats receiving MBP110128 nasally, while similar low levels of MBPreactive TGFβ and IL4 mRNA expressing cells were observed in the two groups. CONCLUSION: Nasal administration of encephalitogenic MBP peptides can induce antigenspecific T cell tolerance and confer incomplete protection to gpMBPinduced EAE, and MBP 6886 and 8799 have synergistic effecs. Nonregulatory mechanisms are proposed to be responsible for tolerance development after nasal peptide administration.

　　[Keywords]nasal tolerance; MBP6886; MBP8799; EAE

　　[摘 要]  目的: 探讨鼻黏膜给予MBP6886和8799协同免疫预防Lewis大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的作用。方法: 合成3条不同的碱性髓鞘蛋白（MBP）多肽（MBP6886、 8799和非致脑炎性肽段110128）, 在用豚鼠MBP（gpMBP）加弗氏完全佐剂免疫Lewis大鼠前的11、 10、 9、 8和7 d, 经鼻黏膜分别给予MBP多肽, 观察其对EAE的保护作用。结果: 致脑炎性肽段MBP6886和8799都有保护作用, 其中MBP6886的保护作用更强; 而MBP110128没有保护作用。鼻黏膜给予MBP6886+8799的混合物, 在相对低的剂量可完全阻断gpMBP引发的EAE。淋巴细胞增殖实验和IFNγ ELISPOT检测显示, 与鼻黏膜给予大鼠MBP110128组相比, 鼻黏膜给予大鼠MBP6886+8799可降低T细胞对于MBP的反应性, 淋巴结单核细胞中表达IFNγ和TNFα mRNA的细胞数减少, 而两组表达TGFβ及IL4 mRNA的淋巴细胞数都低。结论: 鼻黏膜给予致脑炎性MBP多肽能够导致抗原特异性T细胞耐受, 对gpMBP引发的EAE提供不完全的保护, MBP6886和MBP8799具有协同作用。鼻黏膜给予多肽引发的免疫耐受与非调节机制有关。

　　[关键词]鼻黏膜耐受; MBP6886; MBP8799; 实验性自身免疫性脑脊髓炎

　　实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）是一种可致中枢神经系统瘫痪的自身免疫性疾病, 为人类多发性硬化（multiple sclerosis, MS）的实验动物模型。引发EAE动物模型的方法有多种。最常见的是用豚鼠髓鞘碱性蛋白（guinea pig myelin basic protein, gpMBP）和弗氏完全佐剂的混合液免疫Lewis大鼠来建立。MBP致病最主要的抗原决定簇为6886残基[1,  2]。第2个抗原决定簇是8799残基, 为一个很小的表位, 需要给予相对高剂量的MBP8799才能引发EAE。MS的发病率高, 危害严重, 迄今尚无公认的根治方法。近年来, 另一种诱导耐受的方法――经鼻黏膜给予耐受原来诱导耐受, 已逐渐成为新的研究热点[3, 4]。有研究报道, 自身抗原或者自身或外源性抗原的肽段, 均可通过鼻黏膜诱导外周T细胞耐受, 从而保护大鼠不发生自身免疫性疾病[5, 6], 为了进一步探讨引发鼻黏膜耐受的机制, 我们合成了3条不同的MBP多肽（MBP6886、 8799和110128）, 通过鼻黏膜给药比较了它们对EAE的保护作用。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  Lewis大鼠45只, 雌性, 体质量为150～170 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司。MBP多肽6886（YGSLPQKSQRSQDENPV）、 8799（VHFFKNIVTPRTP）和110128（GLSLSAPSTGAGGLPGPG）, 均由北京博奥森公司合成。MBP蛋白提取自豚鼠脊髓, 用SDSPAGE检验其纯度。不完全弗氏佐剂（IFA）购自Difco公司。 硝纤膜96孔培养板购自Millipore公司。抗体购自中杉金桥公司。ConA购自Sigma公司。U型底96孔培养板购自Nunc公司。[methyl3H]胸腺嘧啶购自Amersham公司。玻璃纤维滤纸购自Titertek公司。IFNγ、 TNFα、 IL4和TGFβ基因的杂交探针由上海Invitrogen生物公司合成。

　　1.2  方法

　　1.2.1  诱导鼻黏膜耐受  将MBP6886、 8799、 110128及MBP6886+8799多肽混合物等质量混合分别作为耐受原。所有耐受原临用前用0.05 mol/L pH7.4的PBS溶解。大鼠经乙醚轻微麻醉后用微量吸管给药, 每只大鼠每次给药的总体积为60 μL。每种耐受原鼻黏膜给予的药物剂量和时间, 均分别在图表和图注中说明。

　　1.2.2  EAE动物模型的建立  Lewis大鼠皮下注射接种免疫混合液（25 μg gpMBP、 2 mg结核菌素、 100 μL IFA和100 μL PBS溶液）, 建立EAE模型。评分标准如下: 无症状者为0分; 尾无力者为1分; 无正向反射、 伴或不伴有部分后肢瘫痪者为2分; 后肢完全瘫痪者为3分; 濒死者为4分; 死亡者为5分。

　　1.2.3  引流淋巴结单核细胞（MNC）的制备  免疫后12 d处死大鼠, 取出窝和腹股沟淋巴结（PILN）, 制备单核细胞悬液, 并调整细胞的密度为2×109/L。

　　1.2.4  淋巴细胞增殖实验  于U型底96孔板中, 每孔加入2×109/L PILN 的MNC 200 μL, 设3个平行孔, 分别加入10 μL MBP或MBP多肽（终浓度为20 mg/L）或ConA（终浓度为5 mg/L）, 于37℃、 50 mL/L CO2孵育60 h。加入[3H]胸腺嘧啶（终浓度为1 μCi/孔）于37℃、 50 mL/LCO2孵育12 h, 以玻璃纤维滤纸收集细胞, 用β射线计数器测定cpm值。

　　1.2.5  抗原反应性IFNγ分泌细胞的ELISPOT检测  用小鼠抗大鼠IFNγ 单克隆抗体（mAb）包被硝纤膜96孔板4℃过夜, 然后每孔加入含有4×105 个MNC的细胞悬液200 μL, 每个样本设3个平行孔, 同时加入抗原（MBP蛋白、 MBP多肽或者ConA）, 抗原浓度同淋巴细胞增殖实验, 于37℃、 50 mL/L CO2孵育48 h, PBS洗净。然后每孔加入兔抗大鼠IFNγ多克隆抗体（1∶2000稀释）, 于20℃孵育4 h, PBS洗净。加DAB显色后, 在解剖显微镜下计数阳性细胞数。红棕色的点代表分泌IFNγ的细胞, 没加入抗原或丝裂原而生成的点被认为是自发分泌IFNγ的细胞。用加入抗原或丝裂原产生的点减去没加入抗原或丝裂原产生的点, 即为抗原反应性分泌的IFNγ细胞数, 结果用每105 个MNC中点的个数表示。

　　1.2.6  淋巴结细胞原位杂交（ISH）  实验中对每一种细胞因子的检测, 混合使用2个或4个不同的35S标记寡核苷酸探针（表1）以增加灵敏度。（1）标记探针: 将RNA探针加入杂交液中,  同时加35SdCTP溶液, 于14～16℃的水浴中保温l～2 h, 用β计数仪检测cpm值; cpm≥8×105可用于实验。（2）准备标本: 于U型底96孔板中, 每孔加入2×109/L MNC 200 μL, 不加抗原或加MBP（或ConA）共培养24 h（浓度同淋巴细胞增殖实验）。每组取105 个MNC滴于带电荷的玻片上, 晾干。（3）原位杂交: 将含有35S标记的寡核苷酸探针和末端脱氧核苷酸转移酶的杂交液铺于玻片上, 于55℃杂交16 h。用柠檬酸缓冲液洗去杂交液, 将感光乳胶挂于玻片上, 于暗盒中放射自显影, 于4℃、 14 d后, 取出玻片, 进行显影、 定影、 结晶紫复染, 在显微镜下观察结果。

　　表1  细胞因子探针（略）

　　Tab 1  Cytokine probes

　　1.2.7  统计学处理  两组差异的比较采用Student’st检验; 3组或3组以上差异的比较采用单因素ANOVA检验。

　　2  结果

　　2.1  MBP多肽对模型大鼠EAE的抑制作用  用gpMBP和弗氏完全佐剂引发EAE之前的11、 10、 9、 8及7 d, 每只大鼠通过鼻黏膜每次分别给予不同剂量（0 μg、 12 μg或120 μg）的MBP6886、 8799和110128, 观察EAE的发病情况并评分。经鼻黏膜给予高剂量MBP6886的大鼠EAE的病情减轻, 平均最高分为（0.83±0.76）, 与对照组（3.5±0.5）相比较有统计学意义（P<0.05）, 平均累计得分为（2.3±1.1）, 与对照组（12.62±1.88）相比有统计学差异（P<0.01, 图1A）。经鼻黏膜给予高剂量MBP8799的大鼠, EAE的病情也减轻, 平均累计得分为（5.16±2.58）, 与对照组（12.62±1.88）相比较有统计学意义（P<0.05, 图1B）。给予MBP110128的大鼠没有观察到病情减轻（图1C）。经鼻黏膜给予MBP6886+8799多肽混合物的大鼠（每只每次给予120 μg）, 可完全阻断EAE的发病（图1D）。

　　图1  鼻黏膜给予大鼠不同的MBP肽段对大鼠EAE病情的影响（略）

　　Fig 1  The effects of different MBP peptides administrated through nasal mucous membrane on rat EAE state of illness

　　A: MBP6886; B: MBP8799; C: MBP110128; D: MBP6886+8799.

　　2.2  大鼠淋巴结细胞增殖实验  通过鼻黏膜给予多肽混合物MBP6886+8799或MBP110128后, 用gpMBP加弗氏完全佐剂免疫大鼠。免疫后12 d处死大鼠, 用3HTdR掺入法检测淋巴结MNC对gpMBP蛋白和MBP6886+8799混合多肽的反应性。结果如图2所示, 鼻黏膜用MBP6886+8799多肽混合物免疫大鼠后, 淋巴结MNC对gpMBP蛋白和MBP6886+8799混合多肽的反应性明显下降（P＜0.05）。

　　图2  鼻黏膜给予MBP6886+8799或MBP110128对EAE大鼠淋巴结MNC增殖反应的影响（略）

　　Fig 2  The effects of MBP6886+8799 or MBP110128 administrated through nasal mucous membrane on MNC proliferation of rat lymph nodes

　　A: MBP;   B: MBP6886+8799.

　　2.3  MBP6886+8799对抗原反应性IFNγ分泌细胞的影响  通过鼻黏膜接受MBP6886+8799多肽混合物的大鼠淋巴结MNC中, MBP6886+8799和MBP反应性分泌IFNγ的细胞数显著降低(P＜0.05), 而对MBP110128和PPD反应性分泌IFNγ的细胞数不受影响（图3）。

　　2.4  淋巴结MNC中细胞因子mRNA表达的检测  用不同MBP刺激时, 与MBP110128组相比较, MBP6886+8799组表达IFNγ和TNFα mRNA的细胞数显著降低（P<0.05）; 而两组中表达TGFβ和IL4 mRNA的细胞数都降低（图4）。用ConA刺激时, 两组表达IFNγ mRNA的细胞数相似[MBP6886+8799组为(117±17)个; MBP110128组为(105±23)个]。

　　图3  引发EAE前，经鼻黏膜分别给予MBP6886+8799和MBP110128的大鼠淋巴结MNC对不同抗原反应的分泌IFNγ的细胞数（略）

　　Fig 3  Amounts of antigenreactive IFNγsecreting cells from rats administrated with MBP6886 and MBP110128 through nasal mucous membrane before initiation of EAE

　　图4  细胞因子mRNA表达的原位杂交检测（略）

　　Fig 4  Detection of cytokine mRNA expression by ISH

　　3  讨论

　　关于黏膜诱导免疫耐受的分子机制, 在口服免疫耐受过程中已作了很好的解释。给予高剂量的抗原时可导致克隆删除或无能; 而给予低剂量抗原时所致耐受被认为是调节性T细胞的主动抑制所介导[7]。用gpMBP免疫前, 经鼻黏膜给予大鼠MBP110128可诱发严重的EAE。而给予大鼠高剂量的MBP6886, 只能引发轻微的EAE, 给予高剂量的MBP8799引发的EAE也有一定程度的降低。已证实,  gpMBP分子在Lewis大鼠中致脑炎的活性位点位于MBP6886或MBP8799残基。当鼻黏膜给予MBP6886或MBP8799时, 可引起对EAE的耐受,使疾病减轻; 而对于MBP110128则没有检测到这样的耐受或者保护作用。我们还观察到MBP6886和MBP8799对EAE的抑制作用程度不同, MBP6886的作用比MBP8799强, 这与以前的观点相吻合[8], 即在Lewis大鼠中, MBP6886代表最主要的致脑炎表位, 而MBP8799是一个较小的表位。我们的数据同时表明, 在鼻黏膜免疫耐受中, 只有致脑炎性的MBP表位能引发耐受, 同时抗原呈递必须参与鼻黏膜诱导耐受过程。但是, 尽管在免疫之前给予相对较高剂量的MBP6886和MBP8799, 都没有能完全阻止EAE的发生, 表明这两种肽段都不能单独通过鼻黏膜途径来阻止gpMBP引发的EAE。通过在免疫之前11、 10、 9、 8和7 d分别给予两组大鼠等质量的MBP6886+8799混合物和MBP110128。结果发现, 鼻黏膜给予MBP6886+8799混合物者可完全阻断EAE的发生, 而且MBP6886和8799具有协同作用。以往的研究显示[9], 口服MBP6886诱导免疫耐受时, 每只大鼠所需要的最小剂量为5 mg, 而以相同的肽段进行鼻黏膜免疫时, 每只大鼠只需要600 μg。因此, 通过鼻黏膜途径进行免疫耐受的最大优点, 在于在节省抗原的同时使耐受更加有效。  一些研究认为, 经鼻黏膜给予可溶性抗原, 可能通过免疫调节机制导致外周耐受。IFNγ、 TNFα主要是由Th1型细胞分泌产生, 与EAE疾病的相关。IL4、 IL10、 TGFβ主要是由调节性T细胞分泌产生, 参与免疫调节机制, 与免疫耐受的维持有关。我们通过评估腹股沟和窝淋巴结的MNC中抗原刺激表达细胞因子mRNA细胞的数, 发现经鼻黏膜给予MBP6886+8799耐受大鼠时, 不仅表达IFNγ和TNFα mRNA的细胞数减少, 而且表达TGFβ和IL4的细胞数也减少。以上的结果提示, 通过鼻黏膜给予MBP6886+8799引发的T细胞耐受, 可能是通过T细胞无能或删除途径而不是调节机制来引发的。综上所述, 我们的结果证实, 自身免疫性疾病可通过用肽段代替完整的自身蛋白经鼻黏膜而诱导免疫耐受。鼻黏膜给予肽段的途径, 所用抗原的剂量更小、 更易实现。而且, 具有不同关键表位的肽段的联合应用, 能够产生协同作用来阻止自身免疫性疾病的发展。

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