结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究
作者：王利娴, 卢贤瑜, 李惠, 阳强
【关键词】 结核杆菌H37Ra;,Ag85B蛋白;,小鼠淋巴细胞;,穿孔素;,颗粒酶B
Study on the cytotoxicity of spleen lymphocytes and immune mechanisms in mice immunized by Mycobacterium tuberculosis H37Ra
[Abstract] AIM: To explore the specific cytotoxicity of spleen lymphocytes and the immune mechanisms in mice immunized by Mycobacterium tuberculosis（MTB）H37Ra. METHODS: At the various interval (30days, 60days) after the mice were immunized by MTB H37Ra, BCG and PBS, the spleen lymphocytes of the immunized mice were used as the effector cells while the Sp2/0 cells expressing the secreted protein Ag85B were used as the target cells, and the cytotoxicity of spleen lymphocytes in the immunized mice was measured by MTT assay. Spleen lymphocytes were collected at 60 days after immunization and stimulated with PPD, and the expression of perforin, granzyme B on mRNA level was detected by RTPCR. RESULTS: The cytotoxicity of spleen lymphocytes in the group immunized by MTB H37Ra was significantly higher than that of PBS control group(P<005), and slightly higher than that of BCG group. The mRNA expression of perforin, granzyme B in H37Ra group and BCG group was significantly higher than that in PBS control group (P<005); the expression of perforin mRNA in H37Ra group was significantly higher than that in BCG group (P<005), but there was no obvious difference with regard to the expression of granzyme B mRNA between H37Ra group and BCG group. CONCLUSION: The cytotoxicity of spleen lymphocytes is enhanced after mice were immunized by MTB H37Ra, which may be related to the expression of perforin and granzyme B.
[Keywords]MTB H37Ra; Ag85B protein; spleen lymphocyte; perforin; granzyme B
[摘 要] 目的: 探讨结核杆菌H37Ra免疫小鼠后, 产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。方法: (1)分别以结核杆菌H37Ra、 BCG和PBS免疫小鼠后第30天及第60天, 分离各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞, 以表达Ag85B分泌蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞, 用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的杀伤率; (2)在免疫后第60天, 小鼠脾淋巴细胞经PPD刺激后, 以RTPCR法检测穿孔素mRNA及颗粒酶B mRNA的表达。结果: (1)结核杆菌H37Ra组脾淋巴细胞的杀伤率明显高于PBS对照组(P<0.05), 略高于BCG组; (2)H37Ra组和BCG组穿孔素、 颗粒酶mRNA的表达量均显著高于PBS组（P<0.05）, H37Ra组穿孔素mRNA的表达量显著高于BCG组(P<0.05), 但颗粒酶B mRNA的表达量两组无差异。结论: 结核杆菌H37Ra免疫小鼠后, 能增强脾淋巴细胞的杀伤活性, 其机制可能与增加穿孔素、 颗粒酶B的表达有关。
[关键词]结核杆菌H37Ra; Ag85B蛋白; 小鼠淋巴细胞; 穿孔素; 颗粒酶B
近年来, 由于人口流动的增加, 多重耐药菌株的流行, 以及结核分枝杆菌（MTB）和HIV的双重感染, 导致TB的发病率和死亡率大副度提高。而目前惟一获准使用的卡介苗（BCG）的预防效果又不甚理想, 对不同的人群保护力差异较大, 因此, 世界各国加强了对宿主抵抗结核杆菌免疫机制的研究。H37Ra是由H37Rv（人型结核分枝杆菌标准毒株）多次传代后获得的无毒株。国内外报道, H37Ra具有毒力较低、 抗原性完整[1, 2]及能充分活化巨噬细胞[3, 4]等优点, 因此, 结核杆菌H37Ra作为侯选减毒活疫苗具有相对的优势。然而如何提高CD8+ T细胞的特异性杀伤活性, 是研制新型抗结核疫苗迫切需要考虑的问题。以往结核疫苗的研究中, 有关特异性小鼠脾淋巴细胞杀伤作用的研究较比浮浅。Ag85B是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白, 可诱发对MTB的保护性免疫应答。本研究中拟用能表达此目的蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞, 检测结核杆菌H37Ra免疫小鼠后, 诱导机体产生特异性脾淋巴细胞杀伤活性的效果, 并从分子水平上检测穿孔素、 颗粒酶mRNA的表达, 以探讨小鼠脾淋巴细胞抗MTB感染的免疫机制。
1 材料和方法
1.1 材料 携带有Ag85B分泌蛋白基因的真核表达质粒pTB30m, 由华中科技大学同济医学院微生物教研室范雄林博士馈赠, 本室保存。结核杆菌H37Ra、 BCG菌株由本室保存。Sp2/0细胞由重庆医科大学感染病研究所提供。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂Trizol购自上海生工公司。RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司。PPD标准品购自成都市生物制品研究所。抗Ag85B分泌蛋白的多克隆抗体本室制备。HRP标记的羊抗鼠IgG及二氨基联苯胺(DAB)购自北京中杉公司。G418、 RPMI1640培养液、 MTT和淋巴细胞分离液, 均购自北方同正公司。小牛血清购自GIBCO公司。SPF雌性C57BL/6小鼠, 6～8周龄, 质量18～20 g, 购自重庆医科大学实验动物中心。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 将66只C57BL/6小鼠随机分成3组, 即H37Ra免疫组（24只）、 BCG免疫组（24只）和PBS对照组（18只）。H37Ra和BCG免疫组于每只小鼠尾部皮内, 分别注射H37Ra和BCG菌液各01 mL(含活菌数约2×106个), PBS对照组每只小鼠注射PBS溶液0.1 mL。
1.2.2 Sp2/0细胞中Ag85B mRNA及其蛋白表达的检测 以重组质粒pTB30m转染Sp2/0细胞后, 用琼脂糖凝胶电泳检测Sp2/0细胞中Ag85B mRNA的表达[5], 并用免疫细胞化学染色法检测Ag85B蛋白的表达。
1.2.3 小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测 以携带Ag85B蛋白基因的真核表达质粒pTB30m转染的Sp2/0细胞（16×108/L）为靶细胞, 以免疫后第30天及第60天各组小鼠的脾淋巴细胞（4×109/L）为效应细胞, 按效靶比为25∶1、 50∶1和100∶1, 用MTT比色法进行杀伤实验。具体步骤如下: 于96孔板的实验孔及效应细胞对照孔中, 每孔加入10 μL PPD（终浓度为10 mg/L）, 同时以培养液作为对照孔, 每孔溶液的体积均为150 μL。实验设3个复孔, 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养72 h后, 按上述不同比例的效靶比, 于培养板的实验孔中, 每孔加100 μL靶细胞, 同时以靶细胞作为对照孔, 每孔溶液的体积均为250 μL。于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h后, 每孔加入5 g/L MTT 10 μL, 以1500 r/min离心10 min。吸弃上清, 每孔加入DMSO 150 μL, 振荡10 min, 于波长570 nm用酶标仪测定吸光度（A）值, 并按下列公式小鼠脾淋巴细胞的杀伤率（%）。杀伤率=[1－（效靶细胞的A值－效应细胞的A值）/靶细胞的A值]×100%。
1.2.4 脾淋巴细胞中穿孔素、 颗粒酶B mRNA表达的检测
1.2.4.1 总RNA的提取及cDNA的合成 于免疫后第60 天, 分离各组小鼠（各6只）的脾淋巴细胞, 用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞的密度为4×109/L。在24孔细胞培养板中, 每孔加上述细胞悬液1 mL, 并加入终浓度为10 g/L的刺激物PPD, 于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h, 收集各孔的细胞。用PBS缓冲液洗2次, 采用Trizol法提取总RNA, 并测定RNA的含量, 检测RNA的完整性。按TaKaRa公司RTPCR试剂盒的反转录反应方法, 合成cDNA链。
1.2.4.2 穿孔素、 颗粒酶B 的PCR扩增 （1）引物的设计与合成: 扩增穿孔素基因[6]上游引物的序列为: GAG CCC CTG CAC ACA TTA CTG GAA, 下游引物的序列为ACA TTC TCA AAG TCC ATC T。扩增颗粒酶B基因上游引物的序列为: CTG CTA CTG CTG ACC TTG TCT CT, 下游引物的序列为ATG TCT AGT CCT CTT GGC CTT AC。扩增鼠源性内参照βaction基因上游引物的序列为: GGG AAT GGG TCA GAA GGA CTC, 下游引物的序列为AGA AGG AAG GCT GGA AAA GAG C。（2）PCR反应体系为: 已合成的cDNA模板25 μL、 5×PCR Buffer 25 μL、 灭菌蒸馏水72 μL、 EX Taq HS 006 μL、 上、 下游特异性引物各02 μL（引物浓度均为20 pmol/L）, 混匀后加入到0.2 mL的 PCR管中。反应参数为: 94℃预变性2 min, 94℃变性30 s, 退火（扩增穿孔素基因时为52℃, 扩增颗粒酶B基因时为55℃, 扩增内参照βaction基因时为57℃）30 s, 72℃延伸45 s, 共30个循环后, 再于72℃延伸5 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳, 用图像分析处理系统从凝胶上计算出穿孔素、 颗粒酶B和内参mRNA的照密度, 并用内参照mRNA的密度作为对照, 求出穿孔素、 颗粒酶B mRNA表达的相对值。
1.2.5 统计学处理 检测结果均以x±s表示, 利用SPSS统计软件处理, 组间比较采用进行t检验。
2 结果
2.1 Sp2/0细胞中Ag85B mRNA及其蛋白表达的检测 （1）琼脂糖凝胶电泳分析: 转染重组质粒的Sp2/0细胞的裂解液在880 bp处出现一条明显的带, 而未转染重组质粒Sp2/0细胞的裂解液则无此条带, 表明转染的细胞中有Ag85B mRNA的表达(图1)。（2）免疫细胞化学染色检测: 转染的Sp2/0细胞经G418筛选后, 分别用抗Ag85B分泌蛋白的多克隆抗体作为一抗和HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗, 结果显示, Sp2/0细胞中有棕黄色的颗粒, 表明其可表达Ag85B分泌蛋白（图2）。
图1 Sp2/0细胞中Ag85B mRNA表达的检测（略）
Fig 1 Analysis of Ag85B mRNA expression in Sp2/0 cells
1: Nontransfected Sp2/0 cells; 2: Sp2/0 cells transfected by pTB30m; 3: DNA marker.
图2 Sp2/0细胞中Ag85B蛋白表达的免疫细胞化学染色检测（略）
Fig 2 Detection of Ag85B expression in Sp2/0 cells by immunocytochemical staining（×400）
2.3 小鼠脾淋巴细胞杀伤活性的检测 MTT比色法检测表明, 免疫后第30 天、 第60 天, H37Ra免疫组和BCG免疫组小鼠脾淋巴细胞的杀伤率显著高于PBS组(P<005), H37Ra免疫组的杀伤率略优于BCG免疫组(P<005, 表1)。
表1 小鼠脾淋巴细胞特异性杀伤率的检测（略）
Tab 1 Detection of the specific cytotoxicity of mice spleen lymphocytes
aP<0.05 vs PBS group; cP<0.05 vs BCG group.
2.4 脾淋巴细胞中穿孔素及颗粒酶B mRNA的表达 RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳显示: H37Ra组和BCG组小鼠脾淋巴细胞裂解液中穿孔素及颗粒酶B mRNA的表达量均显著高于PBS组（P<005）。H37Ra组与BCG组相比较, 穿孔素mRNA的表达量有统计学差异（P<005）; 而颗粒酶B mRNA的表达量, 前者略多于后者但无统计学意义（图3、 图4）。
图3 小鼠脾淋巴细胞中穿孔素mRNA表达的检测（略）
Fig 3 Detection of the perforin mRNA expression in mice spleen lymphocytes
M: DNA marker; 1: BCG immunization group; 2: H37Ra immunization group; 3: PBS control group.
2.5 脾淋巴细胞颗粒酶mRNA的表达 免疫小鼠脾淋巴细胞颗粒酶基因PCR产物的电泳结果见图4A, 基因表达的相对值见图4B。结果显示H37Ra组和BCG组颗粒酶mRNA的表达量显著高于PBS组（P<005）, H37Ra组略高于BCG组, 但无统计学差异。
图4 小鼠脾淋巴细胞中颗粒酶B mRNA表达的检测（略）
Fig 4 Detection of the granzyme B mRNA expression in mice spleen lymphocytes
A: Analysis of granzyme B mRNA expression by agarose gel electrophoresis. M: DNA marker; 1: H37Ra immunization group; 2: BCG immunization group; 3: PBS control group. B: The relative density of granzyme B mRNA expression.
3 讨论
Ag85B是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白。本研究中以携带有Ag85B分泌蛋白的真核表达质粒pTB30m转染Sp2/0细胞后, 用RTPCR法检测在Sp2/0细胞内有Ag85B mRNA的表达。免疫细胞化学染色表明, 转染重组质粒的Sp2/0细胞中有Ag85B蛋白表达。采用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞特异性杀伤率, 此法简便易行, 无需预标靶细胞, 与51Cr释放法比较相关性好, 还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。本实验表明, 以结核杆菌H37Ra和BCG免疫C57BL/6小鼠后, 均可产生Ag85B分泌蛋白, 从而便可诱导小鼠脾淋巴细胞特异性地杀伤Sp2/0靶细胞, 且显示H37Ra组小鼠脾淋巴细胞的杀伤率略优于BCG组, 提示结核杆菌H37Ra具有较好的免疫原性, 免疫C57BL/6小鼠后可诱导特异性的细胞免疫应答。检测脾淋巴细胞中穿孔素、 颗粒酶B mRNA表达的结果表明, 穿孔素mRNA的表达量显著高于BCG免疫组, 与脾淋巴细胞杀伤活性的结果相吻合, 其杀伤机制可能与细胞中穿孔素、 颗粒酶B mRNA表达增加有关。BCG不能有效刺激CD8+ T细胞, 从而导致个体产生的保护力有限, 国外报道[7, 8]特异性CD8+ T细胞对靶细胞的杀伤功能在抗结核分枝杆菌感染中具有重要的作用。本研究未分离CD8+ T细胞, 但其结果为结核疫苗的研制提供了一定的实验依据。
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