Raji 细胞系特异性Fab噬菌体抗体库的构建及筛选
作者：谢小芳, 申咏梅, 杨晓春, 董宁征, 白霞, 石怡珍
【关键词】 B细胞淋巴瘤;,Fab;,噬菌体抗体库,
Construction and screening of the specific Fab phage antibody library against Raji cell strain
[Abstract] AIM: To construct and screen the specific Fab phage antibody library against human Raji cell strain in Blymphoma. METHODS: BALB/c mice were immunized with Raji cells, and the antibody light chain к genes and heavy chain genes Fd from the spleen cells were amplified by RTPCR. After restrictive digestion with Sac I/Xba I and Xho I/Spe I, the light chain кgenes and heavy chain genes Fd were inserted into the phagemid vector pComb3HSS successively and then electroporated into E.coli XL1Blue. The specific Fab phage antibody library against Raji cell strain in human Blymphoma was constructed by infection of helper phage VCSM13. The specific antibodies against Raji cells were obtained after selected with Raji cells. The binding activity with antigens was identified by ELISA and the positive clones were sequenced. RESULTS: The Fab phage antibody library with 2.18×107 volume was constructed and eight positive clones which specifically recognized Raji cell strain were isolated. Sequence analysis of the two positive clones showed that the variable heavy domains (VH) and variable light domains (VL) were highly homologous with the registered murine Ig heavy chain V region sequences and kappa light chain sequences, respectively. CONCLUSION: Fab phage antibody library was successfully constructed and specific antibodies against membrane antigens in Raji cells were obtained, which will provide an experimental foundation for the further investigation of Blymphoma immunotherapy.
[Keywords]Blymphoma; Fab; phage antibody library
[摘 要] 目的: 构建针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系噬菌体抗体库并从中筛选出特异性的抗体。方法: 以Raji细胞免疫BALB/c小鼠, RTPCR法从脾淋巴细胞中扩增抗体轻链к和重链Fd基因。经Sac I/Xba I和Xho I/Spe I双酶切, 依次克隆入噬菌体载体pComb3HSS中, 并电转化大肠杆菌XL1Blue, 以辅助噬菌体VCSM13进行超感染, 构建B细胞淋巴瘤Raji细胞系特异性Fab噬菌体抗体库。以Raji细胞为抗原进行筛选, 获得抗Raji细胞的抗体, 通过ELISA法进行抗原结合活性的测定, 并对所得阳性克隆进行基因测序分析。结果: 构建了容量为2.18×107的抗人B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库, 并筛选获得了与Raji细胞系特异性识别结合的8株阳性克隆。对其中两个阳性克隆进行基因序列分析, 结果显示其重链可变区、 轻链可变区分别与免疫球蛋白基因库中已注册的鼠源性免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区序列具有高度同源性。结论: 成功地构建Fab噬菌体抗体库并筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体, 为进一步研究B细胞淋巴瘤的免疫提供了实验基础。
[关键词]B细胞淋巴瘤; Fab; 噬菌体抗体库
恶性淋巴瘤是血液系统常见的恶性肿瘤, 传统的治疗主要包括放疗、 化疗及施行骨髓移植或外周血干细胞移植, 但效果都不十分理想。目前, 单克隆抗体(mAb)在B细胞淋巴瘤免疫治疗中已经获得了令人鼓舞的疗效[1, 2]。但经细胞融合技术获得的mAb本身的一些缺陷限制其在临床上的广泛应用, 如抗体是大分子物质, 很难透过肿瘤周围的毛细血管和间质进入肿瘤组织内部, 致使抗体在肿瘤部位聚集量低, 达不到理想的浓度。噬菌体抗体库技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体, 不经细胞融合, 可制备出针对任何抗原的抗体分子, 利用该技术制备的多为小分子抗体片段, 穿透性强、 抗原性低, 易于携带放射性核素或细胞毒性药物, 进行导向诊断和治疗[3, 4]。我们从人B细胞淋巴瘤Raji细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞RNA出发, 应用噬菌体表面展示技术将全套可变区基因通过抗体Fab段表达在噬菌体的表面, 使表型和基因型联系在一起, 构建全套Fab噬菌体表面展示文库, 并筛选出针对B细胞淋巴瘤Raji细胞系膜抗原的特异性抗体。
1 材料和方法
1.1 材料 pComb3HSS质粒、 宿主菌XL1Blue和辅助噬菌体VCSM13由江苏省血液研究所提供。宿主菌 XL1Blue含有四环素(Tet)抗性基因。辅助噬菌体VCSM13含抗卡那霉素(Kana)抗性基因, 滴度1∶8×1012, 自行培养扩增后4℃保存。Raji细胞、 Daudi细胞及胰腺癌Patu8988细胞株由本室保存。Trizol为GIBCO BRL公司产品; Sac I、 Xba I、 Xho I、 Spe I等限制性内切酶为Biolab公司产品; T4 DNA连接酶及质粒抽提试剂盒为Promega公司产品; MMLV第1链cDNA合成试剂盒为Fermentas公司产品; 胶回收试剂盒为Qiagen公司产品; 酶标二抗为Sigma公司产品; TMB底物溶液为TIANGEN公司产品。引物参照美国Scripps研究所鼠源抗体库构建的引物设计, 由上海生工公司合成, 具体如下（下划线为内切酶位置）:
Heavy chain Fd 3′ primers
IgG 1 5′AGG CTT ACT AGT ACA ATC CCT GGG CAC AAT3′
IgG 2a 5′GTT CTG ACT AGT GGG CAC TCT GGG CTC3′
IgG 3 5′GGG GGT ACT AGT CTT GGG TAT TCT AGG CTC3′
Heavy chain variable 5′ primers
VH1 5′AGG TCC AGC TGC TCG AGT CTG G3′
VH2 5′AGG TCC AGC TGC TCG AGT CAG G3′
VH3 5′AGG TCC AGC TTC TCG AGT CTG G3′
VH4 5′AGG TCC AGC TTC TCG AGT CAG G3′
VH5 5′AGG TCC AAC TGC TCG AGT CTG G3′
VH6 5′AGG TCC AAC TGC TCG AGT CAG G3′
VH7 5′AGG TCC AAC TTC TCG AGT CTG G3′
VH8 5′AGG TCC AAC TTC TCG AGT CAG G3′
VH9 5′AGG TII AIC TIC TCG AGT C(TA)G G3′
к light chain 3′ primer
5′GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA3′
к light chain variable 5′ primers
Vк1 5′CCAGTTCCGAGCTCGTTGTGACTCAGGAATCT3′
Vк2 5′CCAGTTCCGAGCTCGTGTTGACGCAGCCGCCC3′
Vк3 5′CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTCTCCA3′
Vк4 5′CCAGTTCCGAGCTCCAGATGACCCAGTCTCCA3′
Vк5 5′CCAGATGTGAGCTCGTGATGACCCAGACTCCA3′
Vк6 5′CCAGATGTGAGCTCGTCATGACCCAGTCTCCA3′
Vк7 5′CCAGTTCCGAGCTCGTGATGACACAGTCTCCA3′
上述内切酶识别位点分别为Spe I(ACT AGT), Xho I(CTC GAG), Xba I(TCT AGA), Sac I(GAG CTC), I=Inosine。
1.2 方法
1.2.1 动物免疫及脾淋巴细胞总RNA的提取 用2×1010/L的Raji细胞免疫6周龄BALB/c小鼠4只, 4周后进行第2次免疫, 第8周以8×1010/L细胞加强免疫, 加强免疫后3 d从眼眶取血, 用ELISA法检测免疫效果。取免疫后血清滴度较高的2只小鼠处死, 迅速取脾分离淋巴细胞, 以Trizol试剂提取细胞总RNA（按说明书操作）。以总RNA为模板, OligodT(18)为引物, 在逆转录酶MMLV的催化下合成cDNA第1链。
1.2.2 Fd和к链基因的PCR扩增 取上述合成的cDNA 5 μL, 分别加入与轻链к和重链Fd段分别配对的引物各50 pmol/L, 反应总体积为50 μL。循环条件为: 94℃预变性5 min, 然后94℃ 1 min , 50℃ 30 s, 72℃ 90 s, 共35个循环, 72℃ 延伸10 min。反应结束后经15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析, 用QIAEXII胶回收Kit回收目的基因, 以紫外分光光度计进行定量。
1.2.3 Fab噬菌体抗体库的构建 轻链к基因的PCR纯化产物和pComb3HSS载体分别用Sac I/Xba I双酶切后纯化回收, 回收产物用T4 DNA连接酶进行连接, 电穿孔转化XL1Blue菌株, 并扩增培养转化的细菌, 从中提取的质粒即为轻链基因文库。以Xho I/Spe I双酶切重链Fd基因的PCR纯化产物, 与经过同样双酶切的轻链基因文库相连接, 电转化XL1Blue菌株, 迅速加入1 mL SOC培养基, 于37℃振荡培养1 h, 加入10 mL SB培养基(含20 mg/L Amp和10 mg/L Tet), 于37℃振荡培养1 h后补加Amp至50 mg/L, 继续摇菌1 h。加入100 mL SB(含50 mg/L Amp及10 mg/L Tet)培养基和1012pfu的辅助噬菌体VCSM13, 于37℃振荡培养2 h后加Kana至70 mg/L, 37℃振荡培养过夜。次日在离心后的上清中加入40 g/L PEG8000和30 g/L NaCl沉淀噬菌体, 将沉淀悬浮于2 mL 10 g/L BSATBS中, 离心收集上清即为Fab噬菌体抗体库。
1.2.4 抗体库的鉴定和库容测定 以适当稀释度的抗体库感染XL1Blue菌后, 铺于LB/Amp培养皿上, 24 h后计数培养皿上的菌落数, 并随机挑取单个菌落扩增, 从中抽提质粒进行酶切鉴定。
1.2.5 噬菌体抗体库的富集筛选 将Raji细胞包被6孔板, 20 g/L BSAPBS 封闭4℃过夜。加入1 mL/孔 Fab噬菌体抗体库, 37℃孵育2 h, 用适量5 mL/L TBS/ Tween20洗板（第1轮洗1次, 第2轮洗5次, 第3、 4、 5轮均洗10次）。每孔加入1 mL0.1 mol/L HCl(用甘氨酸调pH值至2.2, 含1 g/L BSA)以洗脱噬菌体, 室温静置10 min, 稍吹打后加入2 mol/L Tris中和。用此洗脱液感染2 mL新鲜制备的XL1Blue, 经辅助噬菌体VCSM13感染后进行下一轮的筛选。共进行5轮筛选, 每轮筛选后均测定次级库的滴度, 噬菌体抗体的投入产出比（回收率）, 作为特异性噬菌体抗体富集的指标。
1.2.6 可溶性Fab抗体的表达 第5轮筛选后收集感染的细菌, 提取质粒, 用Spe I及Nhe I双酶切质粒, 除去噬菌体的gIII片段, 自身环化后转化XL1Blue; 挑取单个菌落（Sac I和Spe I双酶切鉴定有Fab基因插入）, 接种于10 mL SB(含50 mg/L Amp, 10 mg/L Tet, 20 mmol/L MgCl2), 37℃振荡培养6 h后, 加入IPTG诱导至终浓度为1 mmol/L, 30℃振荡培养过夜。次日, 4000 r/min 4℃离心15 min。回收上清于4℃储存, 同时用1 mL PBS重悬细菌沉淀, 于-70℃冻结, 再放于37℃水浴溶解, 如此重复4次, 12000 r/min 4℃离心15 min, 上清即含有可溶性Fab抗体。
1.2.7 可溶性Fab抗体的ELISA检测 将上述制备的65个单克隆可溶性Fab抗体以100 μL/孔分别加入Raji细胞、 Daudi细胞及胰腺癌Patu8988细胞包被的ELISA板中, 每块包被板均设空白、 阴性对照, 37℃孵育2 h, 05 mL/L Tween20PBS洗孔3次, 加入新鲜稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG Fab二抗(1∶2000稀释)于各反应孔中, 37℃孵育1.5 h, 洗孔10次后于各反应孔中加入TMB底物显色15～30 min, 3 mol/L H2SO4终止反应, 用自动酶联仪于波长450 nm检测A值, 以大于3倍阴性对照判为阳性。
1.2.8 特异性阳性克隆DNA序列的测定 将上述检测所得A值较高的两个阳性克隆进行细菌扩增, 送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。轻链测序上游引物: 5′GGAATTGTGAGCGGATAA3′, 下游引物: 5′CAGCGAGTAATAACAATCCAG3′; 重链Fd测序上游引物: 5′AGCCGCTGGATTGTTATT3′, 下游引物: 5′GAACCGCCTCCCTCAGA3′。用NCBI BLAST中的Nucleotidenucleotide BAST 和Immunoglobulin BLAST 分析软件, 对所获得的基因测序与GenBank Ig基因库已知序列进行同源性分析。
2 结果
2.1 抗体Fd段和轻链κ基因的扩增 从Raji细胞免疫后的小鼠脾脏分离淋巴细胞, 提取总RNA, 逆转录合成cDNA后, 用一组鼠IgG Fab基因引物, PCR扩增鼠IgG重链Fd和轻链κ基因。图1显示经纯化后的不同轻、 重链PCR产物, 约680 bp左右。
图1 PCR扩增重链Fd段和轻链κ基因结果（略）
Fig 1 Amplification of the light chain κ and the heavy chain Fd fragments by PCR
M: 100 bp DNA marker; 1: Mixed light chain κ; 2: Mixed Fd fragments of heavy chains IgG1; 3: Mixed Fd fragments of heavy chains IgG2a; 4: Mixed Fd fragments of heavy chains IgG3.
2.2 Fab噬菌体抗体库的构建及鉴定 将轻链κ基因扩增产物经Sac I/Xba I酶切、 纯化及与pComb3HSS连接后, 电穿孔转化XL1Blue菌中, 构建κ轻链基因文库。铺板测定其转化子数为4.5×107, 随机挑取9个克隆进行酶切鉴定, 9个克隆均可切出680 bp左右的片段（图2）, 重组率为100%, 实际轻链基因库容量为4.5×107。 将轻链基因文库扩增并抽提质粒, 经Xho I/Spe I酶切、 纯化后, 与经相同处理后的重链Fd段混合、 连接、 电转化XL1Blue菌, 构建Fab基因文库。铺板测定其转化子数为3.5×107, 随机挑取9个克隆酶切鉴定, 7个克隆有重链Fd段的插入（图3）, 即重链Fd段的重组率为78%。随机挑取5个有重链Fd段的质粒再进行Sac I/Spe I双酶切, 4个能切出1500 bp左右的片段(图4), 即既有重链Fd段的插入, 又有轻链κ基因的插入, 重组效率为80%, 实际Fab噬菌体抗体库容量为3.5×107×78%×80%=2.18×107。
图2 轻链κ基因插入的酶切鉴定（略）
Fig 2 Enzyme (Sac I/Xba I) digestion identification of light chain κ insertion
M: 1 kb DNA marker; 19: Clones No.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 cut by Sac I/Xba I contained about 680 bp positive fragment.
图3 重链Fd插入的酶切鉴定（略）
Fig 3 Enzyme (XhoI/SpeI) digestion identification of Fd insertion
M: 1 kb DNA marker; 19: Clones No.1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 cut by Xho I/Spe I contained about 680 bp positive fragment.
图4 Fab插入的酶切鉴定（略）
Fig 4 Enzyme(SacI/SpeI) digestion identification of Fab insertion
M: 1 kb DNA marker; 15: Clones No.1, 2, 3, 4 cut by Sac I/Spe I contained about 1500 bp positive fragment.
2.3 噬菌体抗体库的筛选 以B细胞淋巴瘤细胞株Raji细胞为固相抗原对噬菌体抗体库进行5轮“吸附洗脱扩增”的富集筛选, 将每一轮洗脱下来的噬菌体再感染XL1Blue细菌, 并取少量细菌铺板,测定噬菌体滴度, 每一轮筛选后噬菌体的收获率（表1）。尽管洗涤次数逐轮增加, 但洗脱下来的噬菌体滴度明显增加, 说明在筛选过程中噬菌体抗体得到了一定程度的富集。
表1 亲和筛选对噬菌体抗体的富集效应（略）
Tab 1 Selective enrichment of phage antibody
2.4 抗体特异性的细胞ELISA检测 将65个单克隆制备成的可溶性Fab裂解液经ELISA检测, 结果8个克隆与Raji细胞反应呈阳性; 在8个与Raji细胞反应呈阳性的克隆中, 有6个克隆亦与Daudi细胞反应呈阳性; 而与人胰腺癌Patu8988细胞的反应呈阴性（表2）。
表2 阳性克隆与Raji、Daudi及Patu8988细胞结合反应的ELISA检测结果（略）
Tab 2 ELISA detection results of reactivity between positive clones with Raji, Daudi and Patu8988 cells
2.5 阳性克隆DNA序列的测定 对特异性阳性克隆B6和F11进行测序, 用NCBI BLAST中的Nucleotidenucleotide BAST 和Immunoglobulin BLAST 分析软件, 与GenBank Ig基因库已知序列进行同源性分析。结果证实B6和F11克隆均为鼠Ig的Vκ, 其中B6、 F11轻链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白κ轻链可变区氨基酸序列(NoAAA388881)同源性分别为89%和94%; B6、 F11重链可变区氨基酸序列与GenBank中已注册的鼠免疫球蛋白Ig重链可变区氨基酸序列 (No.P01807)同源性均为92%。通过对B6、 F11进行互补决定区(CDRs)和骨架区 (FRs)定位（图5）, 发现B6、 F11的轻链和重链可变区氨基酸均由3个CDR区和4个骨架区组成, 其中重链CDR3氨基酸序列变化显著; CDR3序列的变化可能与不同的Fab抗体结合不同的抗原有关。
图5 B6 和F11克隆 Fab的轻、 重链可变区氨基酸序列（略）
Fig 5 Amino acid sequences analysis of the variable heavy (VH) and variable light (VL) chain domains of the Fab fragments for clone B6 and clone F11
3 讨论
抗体库技术的出现给肿瘤的免疫带来了新的希望。 国内外有学者利用噬菌体抗体库技术, 研制了抗黑素瘤、 骨肉瘤的Fab噬菌体抗体库[5, 6], 但有关B细胞淋巴瘤抗体库的报道尚未见到。本研究中以人B细胞淋巴瘤Raji细胞免疫BALB/c小鼠, 提取脾淋巴细胞RNA, RTPCR扩增轻链κ基因和重链Fd基因, 分别将之克隆入pComb3HSS载体, 电转化XL1Blue菌株, 经辅助噬菌体VCSM13超感染后成功构建了Raji细胞系Fab噬菌体抗体库。其库容量约为2.18×107, 与国内外应用同一系统构建的抗体文库的容量相近[7]。在实验过程中, 我们选择从免疫过的淋巴细胞构建噬菌体抗体库, 其优点在于相对于未经免疫的淋巴细胞构建的“天然”抗体库而言, 先用淋巴瘤细胞去免疫小鼠, 使小鼠B细胞在建库之前, 经历一个分化成熟和大量增殖的过程, 这样虽然减少了目的抗原抗体的多样性, 但增加了所建库中特异性抗体克隆的比例, 增加了在较低库容量就可以筛选到亲和力较高抗体的可能性。另外, 本研究选择构建鼠源性而未选择人源性抗体库的原因是: 淋巴瘤患者机体存在体液免疫缺陷, 获取的淋巴细胞为材料难以构建有效的人源性噬菌体抗体。故通过B细胞淋巴瘤Raji细胞免疫BALB/c小鼠, 构建鼠源性Fab噬菌体抗体库。目前报道的特异性噬菌体抗体, 多数是用固相纯化可溶性抗原从噬菌体抗体库中筛选而得的, 而用完整细胞作为固相抗原对抗体库进行筛选比用纯化可溶性抗原难度要大, 由于膜蛋白密度的差异及膜分子暴露程度的不同, 对未知抗原的分离鉴定有一定困难, 因而在一段时间内抗体库没有被用于对肿瘤特异性抗体的筛选[8]。但近来在国内外均有用肿瘤细胞作为靶抗原从噬菌体抗体库中筛选出肿瘤特异性抗体的报道[9, 10]。B细胞淋巴瘤的瘤细胞膜上暴露有多种B淋巴细胞分化抗原（如CD20、 CD19、 CD22）, 95%的B细胞淋巴瘤患者的瘤细胞有CD20分子表达, 且表面密度很高, 而在其他正常组织以及多能淋巴干细胞均不表达。基于此, 我们采用B细胞淋巴瘤Raji细胞包被6孔板, 对噬菌体抗体库进行5轮筛选, 每轮噬菌体滴度增加, 噬菌体抗体得到了一定程度的富集; ELISA检测有8个克隆与Raji细胞呈阳性反应, 其中6个克隆还与B细胞淋巴瘤 Daudi细胞呈阳性反应, 进一步证明用此方法筛选是成功的。总之, 我们应用噬菌体表面呈现技术成功构建了抗B细胞淋巴瘤Raji细胞系的Fab噬菌体抗体库, 由此筛选出针对Raji细胞系膜抗原的抗体, 为进一步研究和应用奠定了实验基础。
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