TNF结合肽和TNFR封闭肽对TNF
作者：尹丙姣, 喻明霞, 王晶, 姜晓丹, 李卓娅
【关键词】 TNF
Biological characteristics and effect of TNFα binding peptide and TNFR blocking peptide in vitro
[Abstract] AIM: To investigate the biological characteristics and effect of TNFα binding peptide (TBP) and TNFR blocking peptide (TRBP) in vitro. METHODS: The binding specificity of TBP or TRBP was tested by competition experiment using GFPTNF fusion protein and detected by FCM and fluorescent microscope. The interaction between TBP and TRBP was determined by nondenatured PAGE and the inhibitory effect of TBP and TRBP on TNFα cytotoxicity against U937 was carried out by MTT colorimetry. The effects of TBP and TRBP on the functions of human monocytes activated by TNFα and IFNγ in vitro were detected by nitrotetrazoium blue chlorid (NBT) reduction assay for evaluating respiratory burst and by RTPCR for evaluating IL1β and IL8 mRNA transcription. RESULTS: It was showed that TBP and TRBP was able to block the GFPTNF binding to the TNFR on the surface of cells and no binding interaction took place between TBP and TRBP. Both TBP and TRBP were able to inhibit the TNFα cytotoxicity against U937 and this inhibitiory effect was dosedependent and the combination of TBP and TRBP (pep.38 +X4) was able to inhibit the TNFα cytotoxicity more efficiently than the individual peptide at all tested concentrations. The combination of TBP and TRBP was able to obviously inhibit both respiratory burst of monocytes induced by TNFα and IFNγ and transcription level of IL1β and IL8 mRNA induced by TNFα. CONCLUSION: TBP or TRBP can bind with their ligands specifically and don’t interact with each other. They can also block the biological activity of the TNFα in vitro, and the combination of TBP and TRBP is able to inhibit the biological activity of the TNFα more efficiently. This research will provide an experimental basis for the clinical treatment of the inflammatory disease.
[Keywords]TNFα; TNFα binding peptide (TBP); TNFR blocking peptide (TRBP)
[摘 要] 目的: 检测TNFα结合肽（TBP）和TNFR封闭肽（TRBP）的生物学特性及功能。方法: 以GFPTNF融合蛋白竞争结合实验, 检测TBP和TRBP的特异性。用非变性PAGE检测TBP和TRBP的互补结合性。用细胞毒抑制实验, 观察TBP和TRBP对TNFα杀伤 U937细胞的抑制作用。用硝基蓝四氮唑（NBT）还原能力和RTPCR技术, 检测TBP和TRBP对TNFα诱导的人外周血单核细胞的呼吸爆发和对促炎症因子IL1β和IL8 mRNA水平的抑制作用。结果: TBP和TRBP能抑制GFPTNF融合蛋白与细胞膜上TNFR的结合。非变性PAGE证明, TBP与TRBP之间的结合, 为非配体和受体的结合; TBP和TRBP对TNFα的细胞毒效应均有抑制作用, 且随着剂量的增加而增强, 二者联用(即pep.38+X4)效果更好。TBP和TRBP联用, 能有效地抑制TNFα和IFNγ诱导的单核细胞呼吸爆发的强度, 抑制TNFα诱导的IL1β和IL8 mRNA的转录。结论: TBP和TRBP具有结合TNFα和TNFR的特异性, 但二者的结合为非配体和受体的相互结合。TBP和TRBP对TNFα介导的各种生物学效应均具有抑制作用, 二者联用效果更显著。
[关键词]TNFα; TNF结合肽; TNFR封闭肽
肿瘤坏死因子α（TNFα）是一种主要由活化的单核/巨噬细胞产生的多效性细胞因子, 可参与机体抗肿瘤、 抗感染、 调节免疫应答及炎症反应等多种生理和病理过程[1-3]。在急性炎症反应中, TNFα是一种起始的关键性的细胞因子, 可诱导其他炎性细胞因子（如IL1β、 IL6及IL8）的表达, 从而加剧炎症反应, 引起发热、 内毒素样休克等症状。在类风湿性关节炎、 溃疡性结肠炎及多发性硬化等自身免疫性疾病的发病过程中, TNFα也起关键性作用。因此, 以TNFα及TNFR为靶点设计药物, 可有效地阻断上述病理过程, 达到TNF相关的炎症性疾病的目的。本室曾分别以TNFα和TNFRI为诱饵, 从噬菌体随机环肽库中筛选出能与TNF结合的环九肽, 即TNF结合肽（TNFα banding peptide, TBP）和能与TNFR结合又不激活受体后反应的环九肽, 即TNFR封闭肽（TNFR blocking peptide, TRBP）[4]。本实验中进一步观察了TBP和TRBP对TNFα介导的细胞毒效应、 诱导IL1β、 IL8的表达, 以及促外周血单核细胞呼吸爆发的抑制作用, 为研制TNF相关的抗炎药物奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 STNFα标准品和MTT为Sigma公司产品。TRIzol RNA提取试剂为GIBCO公司产品。RTkit为MBI公司产品。Taq DNA聚合酶为biostar公司产品。PCR引物为上海博亚公司产品。TBP和TRBP由西安美联公司合成并环化, 纯度均为95%。绿色荧光蛋白（GFP）TNF融合蛋白由本室制备。人单核细胞株U937细胞和小鼠成纤维细胞株L929细胞, 均由本实验室保存供实验使用。
1.2 方法
1.2.1 TBP和TRBP抑制TNFα和TNFR结合的作用 取无菌盖玻片, 置于6孔细胞培养板中, 加入1×109个/L对数生长期的L929细胞, 置37℃、 50 mL/L CO2细胞培养箱中培养过夜。取出制作细胞爬片, 用10 g/L多聚甲醛固定细胞30 min。以PBS洗细胞后, 滴加3 mg/L GFPTNF融合蛋白和3 mg/L TBP或TRBP, 置4℃过夜。用PBS冲洗玻片后, 在荧光显微镜下观察结果并拍照。另外, 取1×109个/L 对数生长期的U937细胞用10 g/L多聚甲醛固定后, 加入GFPTNF蛋白和合成环肽(3 mg/L), 置4℃过夜, 用流式细胞术检测。
1.2.2 TBP和TRBP抑制TNFα和TNFR的特点检测 取以RPMI1640培养液溶解TBP(pep.38)与TRBP(pep.X4)（均为2g/L）,将二者等体积混合后,置37℃温箱中孵育30~45min。加入等体积的2×上样缓冲液混匀, 取15 μL进行PAGE, 同时设pep.38和pep.X4对照。电泳完毕后, 取出凝胶用考马斯亮蓝染色4 h, 再用脱色液脱色2 h, 观察结果并拍照。
1.2.3 TBP和TRBP对TNFα杀伤效应的作用 取5×104个对数生长期的U937细胞为靶细胞, 加入到96孔培养板中, 再加入TBP和/或TRBP, 每孔终体积均为100 μL。置37℃、 50mL/L CO2培养箱中培养16~18 h后, 每孔加入MTT 10μL（终浓度为0.5 g/L）, 继续培养4 h, 以1000 r/min离心, 10 min。弃上清, 每孔加入100 μL DMSO, 室温放置15 min。待甲月替完全溶解后, 用酶标仪测定其A570值（以A630 校准）。实验分组: ①TBP组: 将3 mg/L的TBP预先与TNFα（终浓度为5×104/L）混合, 置37℃ 孵育30 min后, 加入到靶细胞悬液中。②TRBP组: 将3 mg/L的TRBP预先与U937细胞混合, 置37℃孵育30 min后, 加入TNFα（终浓度为5×104/L）。③联合多肽组: 将上述两种多肽各减半量, 分别与TNFα和靶细胞孵育30 min后, 再混合培养。同时, 设空白对照组（只加靶细胞作为死亡对照）、 TNFα对照组（阳性对照, 加入靶细胞和TNFα）及无关多肽对照组（阴性对照, 即筛选肽时被洗脱下来的既不与TNF结合, 也不与TNFR结合, 经BLAST证实与人或鼠无关的肽）。细胞的死亡率（%）和细胞毒抑制率（%）的公式是: 细胞死亡率=[(对照组A570值－实验组A570值)/（对照组A570值－空白组A570值）]×100%; 细胞毒抑制率=[1－(多肽/TNF组细胞的杀伤率)/TNF组细胞杀伤率]×100%。
1.2.4 TBP和TRBP对单核细胞的影响 常规分离人外周血单核细胞, 用含100 mL/L FCS的RPMI1640培养液调整单核细胞的密度, 为1×105个/L加入到96孔培养板中, 再加入5000 U/L TNFα和/或5 μg/L IFNγ和或1.0 mg/L TBP和TRBP（联合多肽）, 终体积为100 μL, 每组设3个复孔, 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱中孵育30 min。加入100 μL/孔NBT（2 g/L）, 继续孵育45 min后, 再加入700 mL/L甲醇溶液100 μL/孔固定5 min。弃去上清, 用700 mL/L甲醇溶液洗3次, 置空气中干燥后, 加入120 μL/孔2 mol/L KOH溶液和140 μL/孔的DMSO, 立即混匀, 于波长630 nm测定A值。
1.2.5 IL1β和IL8 mRNA水平的RTPCR检测 取人外周血单核细胞(密度为2×109/L)加入到24孔培养板中（1 mL/孔）, 分别加入各种刺激因子（外源性IFNγ和TNFα）于37℃、 50 mL/L CO2培养箱中培养4 h。细胞总RNA的提取参照TRIzol RNA分离试剂盒的说明书; 逆转录按照Boerhinger Mannheim公司逆转录试剂盒的说明书进行。取2 μL上述逆转录产物作为模板, 分别用扩增IL1β基因的特异性引物（P1: 5′GGC ATC CAG CTA CAA ATC TC3′, P2: 5′CTT GAG AGG TGC TGA TAT AC3′, 扩增片段长约600 bp）; 扩增IL8基因的特异性引物（P1: 5′ATT TCT GCA GCT CTG TGT GAA3′, P2: 5′TGA ATT CTC AGC CCT CTT CAA3′, 扩增片段长约250 bp）和扩增βactin基因的特异性引物（P1: 5′ATC TGG CAC CAC ACC TCC TA3′、 P2: 5′CTC CTT AAT GTC ACG CAC GA3′, 扩增片段长约400 bp）进行PCR。其PCR反应为: 94℃ 30 s; 58℃ 30 s; 72℃ 1 min。从第20个循环开始, 分别以两个循环数的间隔, 进行PCR梯度扩增, 以确定最适循环次数, 然后于72℃延伸10 min。取PCR产物5 μL与1 μL6×DNA上样缓冲液混合, 进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 在紫外灯下观察结果并照相。对产生的特异性条带经灰度扫描后, 进行半定量分析。
2 结果
2.1 TBP和TRBP抑制TNFα和TNFR结合的作用 利用流式细胞术和荧光显微镜技术证实, 合成多肽能抑制GFPTNF融合蛋白与细胞膜上的TNFR结合。其中, TBP(Pep.38)与TRBP(pep.X4) 联用的抑制效果最好, 能使U937细胞结合GFPTNF荧光蛋白的阳性细胞率降低50%, 并可显著减低L929细胞膜上的荧光强度（图1）, 提示人工合成的TBP和TRBP仍具有抑制TNFα和TNFR结合的作用。
图1 TBP和TRBP对GFPTNF融合蛋白与L929细胞TNFR结合的抑制作用（略）
Fig 1 Inhibitory effect of TBP and TRBP on binding of GFPTNF to TNFR on L929 cells(×200)
A: GFPTNF; B: GFPTNF+unrelated peptided; C: GFPTNF+(pep.38+pep.X4).
2.2 TBP和TRBP结合TNFα和TNFR的特点 质谱分析的结果显示, TBP(pep.38)与TRBP(pep.X4)的Mr分别为1102.21和1203.96。理论上, 如果二者能互补结合, 其Mr应>2300, 经200 g/L的非变性PAGE后, 显示的蛋白条带应在二者单独电泳的条带之后。但本实验中将pep.38与pep.X4单独电泳和将二者等量混合, 置37℃温箱中孵育30~45 min后进行电泳。结果显示（图2）, 无论pep.38和pep.X4单独电泳还是将二者混合孵育后电泳, 形成的条带出现均在同一直线位置, 提示二者混合后的抑制作用增强, 与二者同时分别与TNFα和TNFR相结合相关。
图2 TBP和TRBP及TBP加TRBP的PAGE分析（略）
Fig 2 SDSPAGE analysis of TBP, TRBP and TBP plus TRBP
1: pep.38; 2: pep.X4; 3: pep.38+X4.
2.3 TBP与TRBP对TNFα杀伤效应的抑制作用 为了检测人工合成的环肽是否象噬菌体展示的环肽一样有效, 故检测了TBP和TRBP对TNFα杀伤U937细胞的抑制作用（图3）。结果显示, TBP与TRBP对TNFα的杀伤效应均具有抑制作用, 且随着剂量的增加而增强。当剂量增加到10 mg/L时, 抑制效果最好; 若将TBP与TRBP联用（即pep.38+ pep.X4）, 各个剂量的pep.38+ pep.X4的抑制率均显著高于各自单独pep.38和pep.X4作用的抑制率（P<0.01, 图3）。
图3 TBP和TRBP对TNFα介导的U937细胞毒效应的抑制作用（略）
Fig 3 Inhibitory effect on cytotoxicity of U937 cells mediated by TNFα
2.4 TBP与TRBP对外周血单核细胞的影响 利用NBT还原法检测表明, 同时给予外源性IFNγ和TNFα（分别为 5 μg/L和5×103 U/L）激活单核细胞的作用, 明显强于单独的TBP和TRBP的作用, 表现为呼吸爆发的强度显著增强（图4）。TBP和TRBP联用, 能有效地抑制TNFα和IFNγ诱导的单核细胞呼吸爆发的强度, 使反应体系中NBT的还原能力减弱, A630值显著降低（抑制率为56.25%）。RTPCR检测也证实, TBP和TRBP联用能抑制TNFα诱导的IL1β和IL8 mRNA转录的水平（图5）。对RTPCR产物电泳后出现的条带进行扫描显示, 其对IL1β和IL8 mRNA转录的抑制率分别为55.10%和52.53%。上述结果表明, TBP和TRBP可通过竞争性地抑制TNFα与TNFR的结合, 降低单核细胞对IFNγ刺激的敏感性而抑制其活化。
图4 TBP和TRBP对TNFα和IFNγ诱导的外周血单核细胞呼吸爆发的影响（略）
Fig 4 The effect of TBP and TRBP on respiratory burst (RB) of peripheral blood monocytes induced by TNFα and IFNγ
3 讨论
本课题组曾经以TNFRI为诱饵从噬菌体随机线肽库中筛选出TRBP（含14个氨基酸的线肽）[5, 6]。体外实验证实, 其对TNFα的生物学效应具有抑制作用; 但是据报道, 环肽与线肽相比具有较复杂的构象、 稳定好、 生物半衰期长等优点[7]。因此, 本课题组又分别以TNFα和TNFRI为诱饵, 从噬菌体随机环肽库中筛选TBP和TRBP（环九肽）, 本研究通过体外实验进一步证实了其生物学功能。将噬菌体展示的肽进行人工合成, 有可能其空间构象发生改变而影响其效应。因此, 首先必须证实TBP和TRBP是否仍然保留了其分别结合TNFα和TNFR的特性。本研究中, 我们用流式细胞术和荧光显微镜技术证实, 两种合成肽通过分别与TNF和TNFR结合, 而竞争性地抑制GFPTNF与细胞膜上TNFR的结合, 从而使GFPTNF+的U937细胞的比率降低, 荧光强度明显减弱。以上提示, TBP和TRBP与噬菌体上展示的肽一样, 仍具有分别结合TNF和TNFR的活性。本实验中进一步检测了TBP和TRBP对TNFα细胞杀伤效应的抑制作用。结果表明, TBP和TRBP对TNFα的杀伤效应均有抑制作用, 并随着剂量的增加而增强, 而且TBP和TRBP联用(pep.38+ pep.X4)的抑制效果更佳, 这些结果表明, 合成肽与噬菌体展示的肽一样, 同样具有抑制TNFα杀伤靶细胞的效应。本实验证实, 分别用5 μg/L和5×103 U/L的外源性IFNγ和TNFα, 就可诱导人外周血单核细胞的呼吸爆发及IL1 mRNA和IL8 mRNA的转录。但TBP和TRBP可通过竞争地抑制TNFα与人外周血单核细胞表面TNFR的结合, 降低单核细胞对IFNγ的敏感性, 从而抑制单核细胞的活化, 表现为呼吸爆发强度明显减弱, 还原NBT的能力降低; 及使单核细胞中IL1β和IL8等mRNA的水平下降。
文献:
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