类风湿性关节炎基因治疗的病毒载体与基因转移方法的研究进展
作者：刘国玲 综述 梁统, 周克元
【关键词】 类风湿性关节炎（RA）;,基因;,载体
[关键词]类风湿性关节炎（RA）; 基因治疗; 载体
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）, 是一种病因尚不清楚的慢性全身免疫性炎症疾病, 其发病机制也不完全明了。常规的药物治疗及外科手术治疗等均不十分理想, 尚缺乏有效的治疗手段。最近研究表明, 基因治疗显示出了较好的前景。基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入靶细胞以纠正基因的缺陷而发挥治疗作用, 从而达到治疗目的的生物医学高技术。基因治疗中表达载体的构建是治疗成功与否的关键, 理想的载体应该是滴度高、 能转染大量的细胞, 制备方便且重复性好, 能定向进入目的细胞并整合到宿主染色体特异定位点, 能以附加体的形式稳定存在, 转录单元有可调控的操纵元件, 以及不含能激发免疫应答的组分。目前, 在RA的基因治疗中使用的载体系统主要有病毒载体系统和非病毒载体系统。
1 病毒载体系统
病毒载体是指以病毒为基础的基因载体, 是对病毒基因组进行操作和改造, 使之能携带外源基因和相关基因元件, 并被包装成病毒颗粒, 而构建的基因导入系统。目前在RA的治疗中主要有下列几种类型病毒载体:
1.1 反转录病毒载体 反转录病毒属于正链RNA病毒, 是最先被改造且应用最为广泛（>50%）的基因治疗载体。其基因组大约为10 kb, 含有3个最重要的基因: 即gag（编码核心蛋白）、 pol（编码反转录酶）和env（编码病毒外膜蛋白）。基因排列的顺序是5′gagpolenv3′, 两端存在长末端重复区（LTRS）用于介导病毒的整合, env基因中含有病毒包装所必需的序列。反转录病毒载体具有转染率高, 可稳定整合表达、 宿主范围广泛及对宿主的毒性小等优点, 在RA的基因治疗中, 以反转录病毒作为载体已取得很好的治疗效果。用编码MT1MMP反义RNA的重组反转录病毒转染RA患者的滑膜成纤维细胞60 d后进行定量PCR、 Western blot和免疫组化染色检测得MT1MMP反义mRNA是对照组的15倍, 其蛋白的水平大大降低, 关节软骨的损伤和炎症也有很大的减轻[1]。用构建的能分解成纤维细胞中组织蛋白酶L(cathepsin L, CL)mRNA的核酶RzCL533和RzCL790的重组反转录病毒载体转染RA患者的成纤维样滑膜细胞[2], 与对照组相比较CL mRNA分别降低到44%和20%, CL蛋白的水平从16.0 μg/L分别降到4.1和8.2 μg/L, 并明显地减少了软骨的破坏, 关节的炎症反应受到很大抑制。其不足的是, 逆转录病毒只能转染处于分裂增殖期的细胞, 其与受染细胞的整合具有随机性, 有潜在的危险性, 因此, 若要将其安全应用于人体, 还需进一步改造。
1.2 慢病毒（Ientivirus）载体 慢病毒是一类免疫缺陷性病毒, 由于其可引起慢性转染而得名, 属于逆转录病毒家族的成员。慢病毒载体与逆转录病毒载体的主要区别在于, 前者既能转染分裂的细胞, 也能转染非分裂的细胞, 可用于神经细胞、 巨噬细胞、 造血干细胞、 肌肉细胞和肝细胞等[3]。但慢病毒不能转染G0 期细胞, 这是由于在G0 期细胞中慢病毒不能进行逆转录过程[4]。将能表达鼠血管他丁（angiostatin）的人类免疫缺陷病毒载体（HIVvector）注入RA鼠的右侧膝关节[5], 与对照组相比较该鼠此关节滑膜细胞的增生和血管翳的形成明显被抑制。经过改造的含有TNFα基因的有蹄类猫免疫缺陷病毒(FIV)载体也能高效转染SCID鼠膝关节原代滑膜细胞[6]。免疫缺陷病毒载体是基因治疗的一种有效载体, 但仍存在不少问题: 如需要获得产生高滴度和连续的载体细胞系, 制备重构高转化率和高整合率的载体等。
1.3 腺病毒载体 腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒, 其基因组长约36 kb, 含有早期转录区（E1、 E2、 E3、 E4）和晚期转录区（L1、 L2、 L3、 L4、 L5）。E1基因位于基因组的1.0～1.6基因图距单位（Mu）, 为病毒复制的必须区, 缺失E1基因的腺病毒为复制缺陷的腺病毒载体。E3区位于基因组78～86 Mu, 是病毒复制的非必须区, 可作为外源基因的插入区。腺病毒载体通常缺失E1和E3区域。作为基因治疗的载体, 腺病毒载体具有以下显著优点: （1）基因组大, 可插入大片段的外源基因（至多可达35 kb）; （2）可高效地转染不同类型的人组织细胞（体外实验转染效率通常接近100%）;（3）可转染非分裂的细胞; （4）在细胞培养物中有高滴度的重组病毒产量（＞1014/L）; （5）进入细胞后并不整合到宿主细胞的基因组中, 仅瞬间表达, 因而安全性较高, 由于腺病毒载体具有上述优点, 故在RA的基因治疗中被广泛应用。将能表达凝血酶敏感素1（TSP1）的腺病毒载体(AdTSP1)的鼠关节内注射胶原诱导的关节炎(CIA)模型[7], 与对照组相比较, 其CIA的严重程度降低, 血管内皮生长因子（VEGF）生成量减少, TSP1和转化生长因子β（TGFβ）的生成量增加, 滑膜肿胀得到抑制, CIA可得到很大的改善。用复制缺陷性编码ras显性负性突变体基因的重组腺病毒(AxRasDN)转染RA患者的滑膜细胞和原代成纤维样细胞后, 检测结果表明AxRasDN可显著减少滑膜成纤维细胞的增生, 在转录和蛋白水平均可抑制成纤维样细胞分泌的IL1诱导的IL6生成, 使关节炎症得到明显改善[8]。能表达IL13的腺病毒载体在RA模型中降低促炎性细胞因子的生成, 足肿胀体积减少, 骨损伤减弱, 单核细胞、 淋巴细胞和多形核细胞数量等关节炎症的指标明显下降, 炎症得到明显改善; 而腺病毒由于其基因组复杂, 难以构建包装细胞系因而使之应用受到一定的限制。
1.4 腺相关病毒载体 腺相关病毒（adenoassociated virus, AAV）是一种缺陷型非病原性人类细小病毒, 是目前发现的最小、 结构最简单的DNA病毒, 含有1条线状单链DNA, 其复制依赖于辅助病毒（腺病毒或单纯疱疹病毒）, 可转染分裂期及静止期的细胞。AAV载体虽然存在着不能插入较大的外源基因（<4.7 kb）, 缺少高效的包装细胞, 制备过程复杂, 制备滴度低（<104病毒颗粒/mL）等缺陷, 但实验证明, 其可有效地转染脑、 骨骼肌、 肝脏等许多类型的细胞, 其抗原性及毒性很小, 不致病, 可转染非分裂的细胞等优点, 而被许多家所采用。在RA的基因治疗中, AAV载体能有效转染软骨细胞和滑膜细胞。向CIA鼠模型的肌肉内注射能表达IL10基因的rAAV载体, 无论是从放射学、 组织学检查还是从外在表现上, 炎症的发病率和严重度都显著降低[9]。用含有抗血管生成基因的rAAV转染CAI鼠, 炎症也可明显得到抑制。AAV由于其转染效率低, 目的基因呈瞬时表达, 单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。
1.5 疱疹病毒载体 1型单纯疱疹病毒（HSV1）属于人嗜神经病毒, 可在神经元细胞内建立潜伏转染。HSV1可被改造成两类载体: 一是扩增子（amplicon）载体, 即仅把HSV1的复制起点和包装信号序列插入到细菌的质粒中。当其转染至包装细胞后, 用HSV1辅助病毒超转染, 便可获得含有扩增子的假病毒。另一类为重组的HSV1, 即删除了与复制相关的非必需基因, 以减少其对细胞的毒性, 可用于在宿主神经元细胞中长期表达外源性治疗基因。但如果宿主的神经元细胞中已潜伏了野生型HSV, 就很可能重新激活病毒而进入裂解期。松鼠猴疱疹病毒（squirrel herpes virus, SHV）是疱疹病毒家族中的一员, 为双连DNA分子结构, 比较容易转染哺乳动物的细胞。SHV 载体是第一个被应用的基因治疗载体。体内外的实验均证明SHV 载体携带的目的基因可在靶组织中长期持续表达。用编码可诱导抗炎性细胞因子生成基因的重组SHV 载体转染RA大鼠成纤维滑膜细胞, 可检测到IL10的生成较对照组明显升高, IL1β诱导的基质金属蛋白酶3（MMP3）的生成量较对照组明显下降, RA炎症得到明显改善[10]。
2 基因转移的方法
虽然病毒载体作为基因传递的工具已广泛采用, 但病毒性载体仍存在着不少的局限性: 如均可诱导机体产生某种程度的免疫反应, 具有插入突变致瘤、 致毒的风险, 载体的容量有限, 制备滴度不高等。而非病毒载体则具有无传染性、 不限制载体容量, 可大量制备等优点而受到亲睐。目前在RA的基因中应用的非病毒载体主要是质粒DNA, 也可以是无载体的核酸, 如反义寡核苷酸、 核酶及siRNA等。而非病毒载体系统的研究重点和热点更多地放在了对其导入系统的组成和工艺方法的探索和上。质粒DNA进入靶组织的方法主要有以下几种:
2.1 电转移法 体内电转移是适用于向各种组织和器官转运基因的一种物理方法, 也是最常用的一种非病毒载体转移基因的方法。电转移的效率和细胞通透性高度相关。体内电转移已成为人们研究的焦点, 不仅是因为其是最有效的非病毒基因转移技术, 而且成本低、 最易实现、 安全性高, 其效率还可通过改善靶组织的生物扰动性、 质粒DNA的结构和编码蛋白的设计来提高[11]。用这种方法把质粒编码的3种人TNFα的可溶性受体（单体hTNFRIs型、 嵌合体hTNFRIs/mIgG1和hTNFRIs二聚体型[12]）转移进CIA鼠模型, 其蛋白表达可持续6个月, 炎症表现和组织学特征都得到明显改善, 表明电转移是一种有效的转运抑炎性细胞因子或抗炎性细胞因子基因的方法。
2.2 基因枪直接注射法 基因枪是一种专门用于基因转移的高压枪, 可以把平均直径约为4 μm的钨等金属粒子射入细胞中, 若将目的DNA附着在金属粒子表面, 就可以实现基因的直接转移。这种方法的优点是可用细胞或组织直接操作, 给基因转移提供了便利。据报道, 用基因枪向CIA鼠模型直接注射能表达IL4的质粒[13], 可使该鼠炎症的发病率和严重程度明显下降。
2.3 脂质体转染法 脂质体特别是阳离子脂质体作为一种基因转运介质已得到广泛应用, 与其他非病毒基因转运系统一样, 其具有生产简便、 毒性低及无转染危险等优点。脂质体介导的转染技术已被广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞的研究。能表达抗炎性细胞因子（如IL10）的重组质粒, 用脂质体转染佐剂性关节炎大鼠的原代滑膜细胞, 表达的IL10 mRNA和蛋白水平都比对照组有很大提高。把构建的含有IL18基因的真核表达载体（PsecTag2BL18PE38）用脂质体转染RA小鼠的原代软骨细胞后[14], 用荧光免疫细胞化学染色方法鉴定表明与对照组相比较IL18在软骨细胞中可成功表达。但脂质体/DNA复合物与病毒载体相比较其在体内转基因的效率低, 因为脂质体介导的转基因有赖于受染细胞的分裂增殖活性, 而即是在生长旺盛的肺癌组织中处于分裂期的瘤细胞也少于20%。
2.4 人工酵母染色体法 人工酵母染色体法是近年来发展起来的新型载体, 具有克隆百万碱基对级（Mb）的大片段外源DNA的能力, 可以保证巨大基因的完整性; 即保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变, 保证较长的外源基因片段在转基因动物的研究中整合率的提高。由于基因的完整性良好, 目的基因上下游的侧翼序列可消除或减弱基因整合的位置效率。人工染色体表达系统（artificial chromosome expression system, ACE system)就是在此基础上发展起来的一项新的非整合、 非病毒的基因表达系统, 像体内天然染色体一样发挥作用, 较其他表达载体的优点在于可长期稳定地表达目的基因编码的蛋白。把编码LacZ和红色荧光蛋白标记基因的鼠人工染色体移植入佐剂性关节炎鼠的滑膜成纤维细胞中, 24～48 h后检测被移植的人工染色体的表达水平与对照组相比较显著提高。
3 结语
基因治疗目前还处于发展的早期, 其在体外或动物实验中所获的结果尚不能在人体中完全实现, 在临床中的应用还面临许多困难, 包括: 选择更有效的目的基因, 确保载体的安全性, 将带有治疗作用的载体高效率的转移到人体内, 保持这些重组载体在人体内能长期、 稳定地高效表达出预定的基因产物, 有效地将基因治疗与其他治疗方法联合应用, 以及更有效地减轻人体对重组载体的免疫作用等。目前在各种研究中, 病毒载体以其高的转染率等优点已被广泛应用, 但因其容纳外源基因的量少、 稳定性差, 会引起免疫系统的反应等缺点在应用上又受到一定的限制。用非病毒载体来转运基因, 虽然转运基因表达的时间短,转染率低, 但非病毒载体安全可靠、 稳定、 对外源基因的容纳量不限, 不会引起免疫系统的反应和易于生产, 因此, 将是很有前景的基因治疗载体。
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