骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的研究

               作者：徐欣, 孙博, 穆莉莉, 王广友, 金连弘, 李呼伦

【关键词】  实验性自身免疫性神经炎;,骨髓基质干细胞;,Th1/Th2型细胞;,细胞因子

　　Study on therapy of experimental autoimmune neuritis by bone marrow stromal cells

　　[Abstract]  AIM: To investigate the therapeutic effect of bone marrow stromal cells (BMSCs) transplantation on experimental autoimmune neuritis (EAN) and study the possible mechanism. METHODS: EAN model was established by immunizing Lewis rats with P0180199 peptide and complete Freund’s adjuvant (CFA). In the therapy group, BMSCs (2×106 cells/rat) were marked with fluorochrome PKH26 and injected into the rats’ caudal vein 10 d after immunization. The therapeutic effect of BMSC transplantation on EAN rats was investigated by clinical assessment, immunohistochemical staining, and ELISA, respectively. RESULTS: The injected BMSCs could migrate to the demyelinated nerve tissues, and the demyelination and inflammatory infiltration was relieved. The infiltration of CD4+ and CD8+ T cells and the sera level of IFNγ and TNFα were decreased significantly（P<0.05）, whereas  IL4 level in the supernatant of cultured lymphocytes was increased （P<0.05）. CONCLUSION: Certain therapeutic effect of BMSC transplantation on EAN was observed. BMSCs could reverse the disbalance of Th1/Th2 cells by regulating the cytokine expression and could inhibit the activation and proliferation of T cells.

　　[Keywords]EAN; BMSC; Th1/Th2 cell; cytokine

　　[摘 要]  目的: 探讨骨髓基质干细胞（BMSC）移植实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）的疗效以及相应的作用机制。方法: 用P0180199多肽与弗氏完全佐剂的混合液免疫Lewis大鼠, 建立EAN动物模型。治疗组在免疫后第10天, 尾静脉回输荧光染料PKH26标记的BMSC（2×106个细胞/只）, 通过临床评估、 免疫组化及ELISA等方法, 研究了BMSC对EAN的治疗作用。结果: 回输的BMSC能向脱髓鞘神经组织周围迁移, 减轻脱髓鞘的病理改变和炎性细胞浸润。与对照组比较,治疗组CD4+和CD8+ T细胞的浸润显著减少（P<0.05）, 血清中IFNγ和TNFα的水平明显降低（P<0.05）, 培养上清中IL4的水平显著增加（P<0.05）。结论: BMSC静脉移植治疗EAN有一定的疗效。BMSC通过调节细胞因子的表达逆转Th1/Th2型细胞之间的失衡而发挥治疗作用, 并能够抑制T细胞活化增殖。

　　[关键词]实验性自身免疫性神经炎; 骨髓基质干细胞; Th1/Th2型细胞; 细胞因子
   
　　格林巴利综合征（GuillainBarre syndrome, GBS）, 是临床上最常见的急性瘫痪性疾病, 具有较高的致残率和病死率[1], 目前尚未有针对此病特异有效的治疗手段。GBS已经被公为是由CD4+ T细胞介导的自身免疫性疾病, 细胞因子通过改变Th1/Th2型细胞之间的平衡, 主要是增强Th1型细胞的作用, 在疾病损伤中发挥重要作用[2]。骨髓基质干细胞（bone marrow stem cell, BMSC）, 具有很强的自我更新的能力和分化潜能。体内外实验中已发现, BMSC在不同的诱导环境中可分化成不同细胞, 并具有修复各种组织缺损的能力[3]。本实验中利用GBS的动物模型实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis, EAN）为研究对象, 探讨了BMSC移植治疗EAN的疗效以及相应的作用机制, 证实BMSC可通过修补损伤的周围神经髓鞘, 影响Th1/Th2型细胞之间的平衡而发挥作用, 为应用BMSC治疗GBS提供了实验依据。

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  Lewis大鼠, 雌性, 体质量150~160 g, 购自北京维通利华实验动物技术有限公司, 自由食水, 室温（20±2）℃条件下饲养。周围神经髓鞘蛋白P0180199: SSKRGRQTPVLYAMLDHSRS, 购自上海生工生物工程技术服务有限公司。Freund’s佐剂、 红色荧光染料PKH26、 坚牢蓝（Luxol fast blue, LFB）购自SIGMA公司。IFNγ、 TNFα、 IL4 ELISA检测试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司。抗小鼠S100单克隆抗体（mAb）购自武汉博士德生物工程有限公司。小鼠抗大鼠CD4、 CD8 mAb购自BioLegend 公司。ED1 抗大鼠巨噬细胞抗体购自Serotec公司。HRP羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  EAN动物模型的建立  Lewis大鼠10只, 随机分为对照组和治疗组, 每组5只鼠。每只鼠尾根部皮下注射200 μL P0180199 与弗氏完全佐剂的混合乳液, 隔天称重, 观察发病情况。按发病程度分为0～10级, 0级: 无异常; 1级: 尾部张力降低, 尾尖上翘; 2级: 尾瘫, 翻正反射部分缺失; 3级: 翻正反射缺失; 4级: 步态失调、 姿态异常; 5级: 后肢轻瘫; 6级: 中度瘫痪; 7级: 后肢严重瘫痪; 8级: 四肢瘫痪; 9级: 濒死; 10级: 死亡[4]。

　　1.2.2  BMSC的PKH26标记  将0.02%EDTA+0.25%Try消化下的BMSC用无血清DMEM培养液洗涤后, 以400 g离心5 min。取沉积的细胞计数, 每1×107个细胞加入0.5 mL Diluent C重悬后, 加入0.5 mL 4×10-6 mol/L PKH26染料, 室温轻柔混合2～5 min。加入等体积的小牛血清1 mL终止反应, 再加入等体积的DMEM培养液 2 mL稀释。室温下用DMEM培养液洗3次, 以400 g离心10 min,    加DMEM培养液重悬。

　　1.2.3  BMSC 的回输  于免疫后的第10天, 治疗组的每只鼠尾静脉回输0.5～0.6 mL PKH26标记的BMSC悬液（含2×106个细胞）。

　　1.2.4  细胞因子的检测  于免疫后第16天发病高峰时心脏取血, 离心后取血清作1∶2稀释。同时取淋巴结制成淋巴细胞悬液, 加入P0180199（10 mg/L）抗原刺激3 d。将淋巴细胞的培养上清作1∶10稀释, 用ELISA法检测血清和培养上清中IFNγ、 TNFα及IL4的水平。参照ELISA试剂盒说明书, 除空白孔外, 分别将不同浓度的标准品、 待测样品加入相应的孔中, 每个样品设3个复孔, 于37℃孵育90 min。加入生物素化的抗大鼠IFNγ、 TNFα、 IL4, 37℃孵育60 min。加入酶结合物于37℃孵箱孵育30 min。避光于37℃、 OPD显色剂15 min, 终止后测定A450值。

　　1.2.5  T细胞和巨噬细胞的免疫细胞化学染色检测  于发病高峰分离出靠近脊髓腰段的坐骨神经, 作冷冻组织切片（4~6 μm）。以冷丙酮固定20 min, 加预冷的30 mL/L H2O2去离子水溶液灭活内源性过氧化物酶15 min, 加1 mL/L Triton X100溶液通透组织20 min, 再加50 mL/L马血清室温封闭组织1 h。滴加小鼠抗大鼠CD4 mAb 7 mg/L、 小鼠抗大鼠CD8 mAb  7 mg/L及1∶250 ED1抗大鼠巨噬细胞抗体, 于4℃孵育过夜。滴加1∶250 HRP羊抗鼠IgG, 室温孵育2 h, 加DAB显色后,   再以苏木素复染。经梯度酒精脱水、 二甲苯透明后, 封片, 观察结果。

　　1.2.6  组织病理检测  取坐骨神经作石蜡切片, 进行HE染色检测外周神经淋巴细胞的浸润。LFB染色检测外周神经脱髓鞘的病理改变: 石蜡切片脱蜡至水, 浸入LFB溶液中于37℃过夜, 在0.05 g/L碳酸锂溶液中分色10 s, 在700 mL/L酒精中分色30～60 s, 加蒸馏水洗后, 分色至髓鞘在灰白色背景上显出蓝绿色。依次经苏木素复染、 脱水、 脱酒精及封片观察结果。

　　1.2.7  BMSC的双色荧光染色检测  将坐骨神经冷冻组织切片示踪PKH26标记的BMSC, 并滴加1∶50 抗小鼠S100 mAb。于37℃孵育30 min后, 滴加1∶50 FITC标记的山羊抗小鼠IgG, 于37℃孵育30 min。在荧光显微镜下照相、 叠加、 分析。

　　1.2.8  统计学处理  数据以x±s表示, 应用Microsoft Office Excel 2003软件进行处理, 组间比较采用t检验, P<0.05者即有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  临床分级和体重监测  以P0180199 加弗氏完全佐剂免疫后第9天起, 对照组和组均出现临床表现, 于15～16 d发病达高峰（图1）。发病情况的分级为: 对照组平均最高为(4±0)级, 治疗组为(23±06)级, 二者有统计学差异（P<005）。随病情的加重体质量下降, 对照组平均体质量下降的最大值为（737±182） g, 治疗组为（4.15±2.10） g, 有统计学差异（P<0.05）。随着病情好转, 临床症状减轻, 体质量逐渐恢复。

　　图1  EAN大鼠发病情况的分级　略

　　2.2  BMSC的双色荧光染色检测  S100+的周围神经组织呈现绿色荧光, PKH26标记的BMSC呈红色荧光, 可以观察到部分BMSC向脱髓鞘神经组织周围迁移, 并向Schwann细胞分化（图2）。

　　2.3  病理改变与炎性细胞浸润  坐骨神经的病理检查和ED1+巨噬细胞的免疫组化染色检测显示, 对照组有较多炎性细胞浸润, 以血管周围浸润明显,    部分神经出现脱髓鞘改变, 并可见明显的多核巨噬细胞。与对照组比较,治疗组的病理改变与炎性细胞浸润均不明显（图3）。

　　图2  BMSC的双色荧光染色检测　略

　　图3  坐骨神经的病理改变　略

　　2.4  坐骨神经组织中T细胞浸润的检测  将坐骨神经组织切片进行免疫组化染色后, 在100×显微镜下计数每mm2神经组织面积中的阳性细胞数。结果显示, 治疗组中CD4+及CD8+ T细胞数分别为（33.5±9.0）个/mm2及（32.7±2.2）个/mm2; 对照组中分别为（134.0±2.3）个/mm2及（54.9±11.7）个/mm2, 差异显著（分别为P<0.001及P<0.05）。

　　2.5  细胞因子的分泌水平  ELISA法检测结果显示, 治疗组与对照组比较, 免疫血清中IFNγ及TNFα的水平有统计学差异（分别为P<0.01及P<0.05）; IL4的水平无统计学意义。治疗组与对照组比较, 培养上清中IFNγ及IL4的水平均有统计学差异（P<0.05）; 而TNFα的水平无统计学意义（表1）。

　　表1  血清及培养上清中3种细胞因子的水平　略

　　3  讨论

　　近年来, 有学者分别采用不同的方法证实BMSC在体内外均具有向神经细胞分化的潜能[5, 6], 为多种神经系统疾病的治疗提供了新的思路。我们在建立EAN动物模型的基础上, 经尾静脉回输BMSC后, 发现治疗组与对照组比较, 病情程度的分级呈下降趋势, 平均最高分级和平均体质量下降的最大值均有统计学差异（P<0.05）。病理检查发现, 与对照组比较, 治疗组坐骨神经的脱髓鞘与炎性细胞浸润均不明显。荧光双标记示踪显示, BMSC向脱髓鞘周围神经组织的炎症反应部位迁移, 并向Schwann细胞分化, 提示在静脉移植治疗EAN的过程中, BMSC能够减轻EAN大鼠的临床表现及病理改变, 促进损伤组织的修复, 有一定的治疗效果。免疫组化结果显示, 与对照组比较, 治疗组CD4+及CD8+ T细胞数均显著性下降（分别为P<0001和P<005）, 提示BMSC可能通过抑制致敏的淋巴细胞活化增殖, 恢复CD4+/CD8+之间的平衡而发挥治疗作用。有研究表明, BMSC能同时抑制CD4+与CD8+ T细胞增殖, 且与其释放的细胞因子HGF、 TGFβ1有关[7]。也有研究表明, BMSC可通过调节性CD8+ T细胞发挥抑制作用, 发现CD8+亚群受抑较明显[8]。另有研究发现, BMSC的抑制作用并不需要CD4+/CD25+调节性T细胞[9] 。因此, 推测调节性CD8+ T细胞的诱导可能是BMSC发挥抑制作用的机制之一。ELISA结果表明, 与对照组比较, 治疗组免疫血清中IFNγ和TNFα的水平均显著降低（P<005）, 培养上清中IFNγ的水平显著性降低（P<005）, 提示BMSC可能通过抑制T细胞而降低外周血中IFNγ和TNFα的水平, 从而减轻炎症反应。与对照组相比较, 治疗组的培养上清中IL4的水平显著升高（P<005）。有研究表明, IL4与GBS患者的恢复有关, 下调Th1细胞和巨噬细胞应答, 有助于GBS 病情的恢复[10]。BMSC可能通过分泌TGFβ1抑制T细胞应答[7]。总之, BMSC具有取材方便, 增殖能力强, 可自体移植等优点, 在神经系统疾病的细胞治疗中, 具有广阔的临床应用前景。但尚有一些问题, 如移植后BMSC的存活时间及体外培养的最适条件等。随着这些问题的解决,    其将会得到更广泛的应用。

　　:

　　[1] Kehoe M. GuillainBarre syndromea patient guide and nursing resource[J]. Axone, 2001, 22(4): 16-24.

　　[2] Bao L, Lindgren JU, van der Meide P, et al. The critical role of IL12 p40 in initiating, enhancing, and perpetuating pathogenic events in murine experimental autoimmune neuritis[J]. Brain Pathol, 2002, 12(4): 420-429.

　　[3] Barry FP. Biology and clinical applications of mesenchymal stem cells[J]. Birth Defects Res C Embryo Today, 2003, 69(3): 250-256.

　　[4] Cavaletti G, Mata S, Fasano A, et al. Lipidfree versus lipidbound P2 proteininduced experimental allergic neuritis: clinicopathological, neurophysiological, and immunological study[J]. J Neurosci Res, 2000, 62(5): 709-716.

　　[5] Dezawa M, Kanno H, Hoshino M, et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation[J]. J Clin Invest, 2004, 113(12): 1701-1710.

　　[6] MunozElias G, Marcus AJ, Coyne TM, et al. Adult bone marrow stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and longterm survival[J]. J Neurosci, 2004, 24(19): 4585-4595.

　　[7] Di Nicola M, CarloStella C, Magni M, et al. Human bone marrow stromal cells suppress Tlymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J]. Blood, 2002, 99(10): 3838-3843.

　　[8] 宣  , 邱国强, 谢晓宝. 间充质干细胞对混合淋巴细胞反应体系中T淋巴细胞的免疫调节作用[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22（4）: 433-435.

　　[9] Krampera M, Glennie S, Dyson J, et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive andmemory antigenspecific T cells to their cognate peptide[J]. Blood, 2003, 101(9): 3722-3729.

　　[10] 方  伟, 刘洪波, 方树友, 等. 格林巴利综合征患者血清IFNγ、 IL4水平及意义[J]. 实用神经疾病杂志, 2005, 8（1）: 2-4.