HA-1树突状细胞核酸疫苗的构建及其特异性CTL的诱导
作者：汪涯雅，张东华，刘文励，周红升，张路，戴敏，黄振倩， 谭获 熊平
【摘要】 本研究以次要组织相容性抗原HA-1为靶点，构建HA-1树突状细胞核酸疫苗用于造血干细胞移植后抗白血病。体外培养移植供者树突状细胞，用流式细胞术、混合淋巴细胞反应检测其免疫活性，通过电转法将HA-1基因转染树突状细胞，构建树突状细胞核酸疫苗。48小时后检测HA-1蛋白表达情况。将转染后的树突状细胞与同基因淋巴细胞共孵育诱导特异性CTL，应用LDH释放实验检测其体外杀伤活性。结果表明：经外周血单核细胞诱导的树突状细胞表达树突状细胞表型，能刺激同种淋巴细胞增殖。电转48小时后，Western blot可检测到HA-1蛋白表达。诱导的CTL体外杀伤活性高于对照组。结论：次要组织相容性抗原HA-1可作为造血干细胞移植后抗白血病治疗的靶点。
【关键词】 树突状细胞； HA-1基因; 树突状细胞核酸疫苗; 造血干细胞移植; 细胞毒性T淋巴细胞
Construction of HA-1-DC Nucleic-acid Vaccine and Induction of Specific Cytotoxic T Lymphocytes
AbstractThe purpose of this study was to construct a HA-1-DC nucleic acid vaccine and to induce anti-leukemia effect after hematopoietic stem cell transplantation(HSCT). The dendritic cells (DCs) were generated from HSCT donors in vitro, and its immunologic activity was studied by using flow cytometry and mix lymphocyte reaction. HA-1 gene was electroporated into the cultured DCs to construct a DC nucleic acid vaccine. After transfecting for 48 hours, the expression of HA-1 protein was detected by Western blot. The DCs were cultured with isogenic lymphocytes to induce specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). The cytotoxicity of the CTLs was detected by LDH assay. The results showed that the DCs derived from peripheral blood monocytes (PBMCs) expressed the DC phenotype, and were effective in stimulating proliferation of the allogenic lymphocytes. After electroporating for 48 hours, HA-1 protein was detected by Western blot. The cytotoxity of inducing CTLs was higher than that in the control group. It is concluded that the minor histocompatibility antigen HA-1 can be considered as a target of immunotherapy against leukemia after HSCT.
Key wordsdendritic cell； HA-1 gene； DC nucleic acid vaccine； hematopoietic stem cell transplantation； cytotoxic T lymphocyte
树突状细胞（dendritic cell, DC）是目前体内功能最强的专职抗原呈递细胞（antigen presenting cell, APC），它们能高效摄取、处理抗原，并将多肽呈递给静息型T细胞，诱导特异性免疫应答，因而成为肿瘤免疫治疗中重要的运载工具。通过转基因技术，将编码肿瘤表面的抗原基因导入DC构建相应的核酸疫苗，是近来肿瘤免疫治疗的热点［1，2］。异基因造血干细胞移植（allogeneic hemato- poietic stem cell transplantation, allo-HSCT） 是治疗白血病最有效的方法， 但移植后移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)和复发严重影响了病人的存活率。如何增强移植物抗白血病（graft versus leukemia, GVL）效应，减少复发同时又不诱发GVHD，是移植成功的关键。限制性表达于造血干细胞和白血病细胞表面的次要组织相容性抗原（minor histocompatibility antigens, mHags）在分离GVL和GVHD中起重要的作用［3］。 因此， 本实验应用HA-1基因构建真核表达载体，转染DC，诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs），发挥抗白血病效应。
材料和方法
材料
人重组IL-4和GM-CSF均购自Peprotech公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂，RPMI 1640、丝裂霉素C、MTT均为Sigma公司产品，胎牛血清（FCS）购自杭州四季清公司。PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD80和CD14、FITC标记的鼠抗人单克隆抗体CD83和CD86及同型对照均购自eBioscience公司。XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶、1 kb DNA Marker购自MBI公司。胶回收、质粒小提、大提试剂盒均购自上海华舜公司。T4DNA连接酶为Promega公司产品。抗his单克隆抗体购自Novagen公司。人IL-2购自北京四环生物制品厂。pcDNA3.1/hisA和pEGFP-C1 由我院妇科肿瘤中心陈刚博士惠赠，pcDNA3.1-HA-1由荷兰勒登(Leiden)大学医学中心Dr.Prof.E.A.J.M.Goulmy惠赠。流式细胞仪（Becton Dickinson公司产品），电转仪（ECM2001 BTX公司产品），电转杯（8mmgap,GTS公司产品），酶标仪（Biotech公司产品）。
方法
DC体外培养取HA-1阴性表达的移植供者外周血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，PBS液洗涤3次，用RPMI 1640培养液悬浮细胞，按5×106/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，置37℃、5％ CO2培养箱中培养2小时，轻轻吹打去除悬浮细胞，即获得贴壁的外周血单核细胞（PBMC），每孔加入2 ml含10％FCS的RPMI 1640培养液，加入细胞因子rhGM-CSF 100 ng/ml及rhIL-4 40 ng/ml。隔天半量换液，补充细胞因子。于培养第7天收集悬浮细胞。
流式细胞术分析表型DC悬液用PBS液洗涤2次，调整细胞浓度为1×106/ml，加入Eppendorf管，每管100 μl，再分别加入PE标记的CD80、CD14及FITC标记的CD83、CD86，4℃避光孵育30分钟，PBS液洗涤，1％多聚甲醛固定后上流式细胞仪检测。
同种混合淋巴细胞反应分离健康人外周血获得单个核细胞，在培养箱中培养2小时，收集悬浮细胞即同种异体淋巴细胞作为反应细胞，刺激细胞（DC及同基因的PBMC）用完全培养液调整浓度为1×106/ml，加入终浓度25 μg/ml的丝裂霉素C，37℃孵育30分钟，PBS液洗涤3次，用含8％FCS的RPMI 1640培养液悬浮调整浓度，分别以1×103/孔、5×103/孔和1×104/孔加入96孔板中，每组设3个复孔，每孔再加入1×105反应细胞，终体积为200 μl，以未加刺激细胞的淋巴细胞为阴性对照。37℃、5％ CO2 培养72小时，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，避光37℃温箱中孵育4小时，离心去上清，每孔加入200 μl DMSO,取波长570 nm检测A570值。结果用3孔均值表示。
刺激指数（SI）=加刺激细胞孔的A570值/阴性对照孔的A570值。
重组人HA-1质粒的构建用XbaI和BamHI限制性内切酶从
pcDNA3.1-HA-1中切下358 bp HA-1的cDNA，其中包括T细胞决定簇VLHDDLLEA，经T4DNA连接酶插入pcDNA3.1/hisA的多克隆位点中，经过酶切和测序确定重组是否准确，命名为pcDNA3.1/hisA-HA-1。
转染DC收集培养7天的DC，用RPMI 1640培养液洗涤，电转缓冲液（按Eppendorf公司提供的缓冲液配方配置，保证细胞在其中孵育30分钟，存活率在90％以上）重悬细胞，调整浓度为1×106/ml，加入重组质粒，终浓度为20 μg/ml。电转条件为：常温，电压450 V，80微秒，脉冲1次。在30分钟内完成，加入完全培养液，置于温箱内继续培养24-72小时。同时用pEGFP-C1转染作对照，评价DC的转染效率。
蛋白表达的Western blot检测于转染48小时后收集细胞，用一步裂解法提取总蛋白，经98℃变性5分钟后，垂直电泳。再用电转仪将凝胶中的蛋白转移到醋酸纤维膜上，5％脱脂奶封闭，加His单克隆抗体（1∶1 000），4℃过夜，TBS-T液洗3次，再加入HRP标记的二抗（1∶200），37℃恒温摇床摇动2小时，TBS-T洗涤3次，于暗室中用化学发光法显色。
CTL的诱导及其杀伤活性的检测转染48小时后的DC与同基因淋巴细胞按1∶10混合孵育于24孔板中，每孔加入IL-2 1 000 U/ml，另设未转染的DC为阴性对照，培养5天，中途补充IL-2，收集淋巴细胞（CTL为主）为效应细胞，调整浓度为5×106/ml。取HLA相合而HA-1阳性表达的受者分离出的外周血单个核细胞为靶细胞，调整浓度为1×105/ml。将效应细胞和靶细胞各100 μl加入96孔板中，每组设3个复孔，并设靶细胞最大释放组和释放组。145 ×g离心2分钟，置培养箱中孵育6小时，吸取各孔上清置37℃预温10分钟，加入LDH底物溶液，每孔100 μl，室温避光反应12分钟，每孔加入1 mol/L柠檬酸终止液30 μl，终止酶促反应。于波长570 nm处用酶标仪测量各孔A值，结果以3孔均植表示。
杀伤活性=［（实验组A值-自然释放组A值）/（最大释放组A值-自然释放组A值）］×100%。
统计学分析
实验数据以X±SD表示，用t检验，P<0.05具有统计学意义。
结果
DC体外培养
在细胞因子GM-CSF和IL-4的共同作用下，PBMC培养2天时，可见团簇生长、半悬浮状态的细胞集落。第4天时，集落增多，细胞胞体明显增大，但细胞边缘少见毛刺状的突起。至第7天，集落已消散，可见大量细胞悬浮在培养基中，镜下呈典型的DC形态，边缘模糊有毛刺状突起（图1）。收集悬浮细胞计数，每孔约有（1-2）×106个DC。
表型的流式细胞术分析
经GM-CSF和IL-4诱导，PBMC分化为DC，具有典型的DC表型，CD80、CD86高表达，分别为88％和93％，CD83亦高表达，为85％，而单核细胞的特异性标记CD14呈低表达，为13％。结果符合DC的表面分子变化（图2）。
混合淋巴细胞反应
以未加刺激细胞的淋巴细胞为对照，结果显示DC具有很强的刺激同种异基因淋巴细胞增殖的功能。DC在各个浓度的刺激指数(SI)明显高于同基因PBMC的SI，差异具有显著性（P<0.05）（图3和表1）。Table 1. Stimulation index (SI) of DCs and isogenic PBMCs at different cell population
Cell population（略）
重组人HA-1质粒的构建与鉴定
重组质粒pcDNA3.1/hisA-HA-1经XbaI和BamHI双酶切，可获得与pcDNA3.1-HA-1上酶切下来的相同长度目的基因片段，结果见图4。经测序鉴定，质粒中含有编码HA-1的358 bp cDNA，其中包括T细胞决定簇VLHDDLLEA，证明重组准确（图5）。
pcDNA3.1/hisA-HA-1.转染DC
用pEGFP-C1转染作对照，24小时后有绿色荧光，48小时后最强，72小时后开始减弱。转染效率为15%，提示用电转的方法可以将质粒转入DC。
Western blot检测蛋白表达
结果证实，转染pcDNA3.1/hisA-HA-1的DC在48小时后能检测到HA-1蛋白表达（图6）。
LDH释放实验检测CTL的杀伤活性
结果显示，DC核酸疫苗诱导的CTL对靶细胞的杀伤活性高于对照组为40.51%，而未转染的DC诱导的淋巴细胞，杀伤活性仅为13.61%，差异有显著性（P<0.05）（表2）。Table 2. Cytoxicity of the CTLs induced by DC nucleic acid vaccine to target cells GroupA570Cytotoxity（略）
讨论
allo-HSCT后，GVHD和GVL常相伴发生，如何提高移植后GVL作用，同时避免GVHD是当今研究的热点。选择仅表达于白血病细胞表面的抗原，利用这种抗原刺激供者DC，诱导特异性免疫应答杀伤白血病细胞发挥GVL作用，而对宿主的正常组织却不产生损害，从而避免了GVHD。mHags HA-1限制性表达于造血干细胞和白血病细胞表面，是分离GVL和GVHD的理想靶抗原。首先，mHags能有效诱导GVL效应，移植后引起复发的机制之一就是宿主对供者的mHags产生耐受，若用针对mHags的免疫可诱导抗肿瘤效应，而且这种抗原是肿瘤生存必需的，在肿瘤生长和迁移过程中不丢失，从而不能逃避机体免疫系统识别［4］。此外限制性表达于造血系统可以避免加重GVHD。因此，我们选择HA-1作为DC核酸疫苗的目的基因。供者DC在过继免疫治疗中发挥重要作用，但DC仅占外周血单个核细胞总数的0.5%－1％，难以分离和纯化，因此限制了其临床应用。本实验通过GM-CSF和IL-4诱导PBMC，可获得大量的功能性DC。流式细胞术和混合淋巴细胞反应的结果显示，培养7天后的DC高表达抗原呈递分子，并能有效地刺激同种淋巴细胞增殖，从而解决了DC用于临床治疗细胞数不足的问题。DC的核酸疫苗能将肿瘤表面抗原蛋白有效负载DC，增强疫苗的刺激效应。应用病毒载体能有效地转染DC，但它们能抑制DC的抗原呈递功能［5，6］；此外,病毒自身携带的免疫优势抗原会干扰机体对靶抗原的免疫应答［7，8］，用于临床治疗也缺乏安全性。电转染mRNA可以获得与病毒转染相当的转染效率，但mRNA不稳定，也不能获得抗原持续的表达，不利于DC持久发挥作用。我们选择质粒DNA电转染DC，虽然转染效率为15％，但由于DC具有强大的抗原呈递能力，较少的细胞和较少的抗原就能刺激产生大量特异性CTL。本实验提示，用电转法制备的DC疫苗可以在体外有效地诱导CTL产生。但在IL-2作用下，反应体系中有NK细胞的生成，为了避免干扰CTL的杀伤效应的观察，我们设定未转染的DC与淋巴细胞共培养检测其杀伤活性作为阴性对照。由于CTL作用于靶细胞具有MHC限制性，难以找到合适的肿瘤细胞株，我们选择HLA相合而HA-1阳性表达受者的外周血单个核细胞作为靶细胞，这样可以解决该问题。阴性对照可以避免受者的细胞对实验观察的影响，但DC核酸疫苗的体内活性还需要进一步探讨。HA-1阳性的白血病患者，接受HLA相合而HA-1阴性的供者allo-HSCT后，用我们的真核表达载体转染供者的DC，刺激供者淋巴细胞，诱导针对HA-1的特异性CTL，回输给宿主发挥GVL效应，杀伤白血病细胞，而不损伤非造血组织，因此不会加重GVHD，且供者造血干细胞HA-1阴性表达，也不会受到攻击。本实验为解决allo-HSCT后如何分离GVL和GVHD找到了一个切入点。由于HA-1是正常组织的基因，输入人体不存在安全隐患，且电转染也是一种较为安全的转染方法，因此用于HSCT后患者的免疫治疗是安全可靠的。
【】
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