单链可变区片段与趋化因子融合的独特型淋巴瘤疫苗原核表达质粒的构建及表达
作者：王福旭 赵冰 程云会 潘崚 罗建民 张学军 董作仁
【摘要】 本研究目的在于克隆小鼠 B 细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv- MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码 (Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv- MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGLo中，并在大肠杆菌中表达融合蛋白。测序结果表明：分别成功克隆A20细胞的Ig VH 和Ig VL基因，并成功制备了scFv片段和scFv- MCP-3融合基因片段；限制性酶切方法证实，重组pGLo/scFv- MCP-3原核表达质粒中融合基因准确插入。SDS-PAGE电泳分析显示，融合蛋白分子量约65 kD, 与预期蛋白分子量一致，并且目的蛋白占菌体蛋白的30%。 结论：本研究成功构建鼠源scFv片段与趋化因子MCP-3融合的独特型B细胞淋巴瘤疫苗表达质粒pGLo/scFv- MCP-3，并实现融合蛋白的初步表达。
【关键词】 本研究目的在于克隆小鼠 B 细胞淋巴瘤细胞膜免疫球蛋白（Ig）的单链可变区片段（scFv），与单核细胞趋化因子（MCP-3）的基因融合，构建融合基因scFv- MCP-3的表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备作为治疗B细胞淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。采用RT-PCR法扩增BALB/c小鼠源B细胞淋巴瘤A20细胞株的Ig VH和Ig VL基因，重组PCR法用一段编码 (Gly4Ser)3连接肽的基因序列连接两基因，制备scFv片段。用相同PCR方法，选用一段编码NDAQAPKS连接肽的基因序列，连接scFv与MCP-3基因，获得scFv- MCP-3融合基因片段。定向克隆到原核表达质粒pGL
Construction and Expression of A Prokaryotic Expression Plasmid of Idiotypic Vaccine against B Cell Lymphoma： Encoding the Fusion Genes of Single-Chain Variable Fragment and MCP-3
Department of Hematology, The Second Hospital; 1Department of molecular biology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China
AbstractThe aim was to construct a prokaryotic expression plasmid encoding the fusion gene of single-chain variable fragment and monocyte chemotactic protein-3 (MCP-3). The cDNAs of immunoglobulin (Ig) VH and Ig VL were amplified by RT-PCR and assembled into the single-chain variable fragment（scFv） by recombinant PCR method. The cDNAs of Ig VH and Ig VL were connected by a (Gly4Ser) 3 linker. Then, the fragments of scFv and MCP-3 were connected with a NDAQAPKS spacer, using recombinant PCR method again. The results indicated that the fusion gene of scFv-MCP-3 were constructed correctly and cloned into the prokaryotic expression plasmid successfully identified by sequencing and restriction endonucleases examination. Finally, the fusion protein was expressed in E coli DH5α under induction by arabinose. And the fusion protein was 65 kD and account for 30% of the total protein of the bacteria. In conclusion, a prokaryotic plasmid, encoding the fusion gene of single-chain variable fragment with MCP-3 and expressing idiotype protein vaccination against B cell lymphoma, was constructed correctly.
Key wordsrecombinant idiotype vaccine; B cell lymphoma; scFv; monocyte chemotactic protein-3
B细胞淋巴瘤细胞表面的独特型膜免疫球蛋白 (smIg) 是一种明确的肿瘤相关性抗原（tumor associated antigen, TAA）［1］，结合免疫佐剂主动免疫后能诱导抗淋巴瘤肿瘤免疫应答［2］。研究表明，单链可变区片段（scFv）可以模拟完整的免疫球蛋白的抗原性, 具有相对分子量小、组织穿透力强、血浆清除快、易于基因改造并可通过细菌发酵大量生产等优点［3］ ，有很大的临床应用潜力。本研究中我们以BABL/c小鼠源的B细胞淋巴瘤细胞株A20作为模型, 单核细胞趋化蛋白MCP-3 ( monocyte chemotac-tic protein -3) 为免疫佐剂，运用抗体工程和基因工程技术，制备A20细胞的独特型smIg的scFv片段，并与同种鼠源的MCP-3基因连接，构建原核表达载体pGLo/scFv- MCP-3，并在大肠杆菌中实现高产量表达融合蛋白，为进一步纯化及作为融合蛋白疫苗进行主动免疫治疗的实验研究提供了基础。
材料和方法
细胞、质粒和菌种
源于BALB/c小鼠的B细胞淋巴瘤细胞株A20购自美国ATCC。含有BALB/c小鼠源的MCP-3 基因序列的质粒为中南大学湘雅医学院肿瘤研究所胡锦跃教授惠赠。原核表达质粒pGLo及大肠杆菌DH5α株为本室保留。
酶和主要试剂
高糖 DMEM购自美国Gibco公司。FBS为杭州四季青产品。TRIZOL RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司。Pfu酶、Taq酶、DNA Marker、胶回收纯化试剂盒、质粒小量抽提试剂盒购自上海生工公司。其它RT-PCR相关试剂及克隆载体pGEM-T easy为Promega产品。限制性内切酶SacⅠ，KpnⅠ、T4连接酶购自TaKaRa公司。
引物设计
根据［4］报道的A20细胞Ig VH cDNA序列leader区与FR4区，自行设计引物VH0 5'、VH0 3'，并通过引物设计软件Primer 5验证引物的有效性。Ig VL cDNA 扩增引物VL0 5'、VL0 3' 根据小鼠κ链FR1区和恒定区设计，经相同方法验证有效性。构建的重组质粒如图1所示，载体pGLo携带有GFP（绿色荧光蛋白）基因，重组的scFv- MCP-3融合基因片段插入到GFP编码区的下游，并保持与前者一致的开放性读码框。IgVH、IgVL 基因片段由编码（Gly4Ser）3 的基因序列连接，IgVL与MCP-3基因片段以编码氨基酸序列为NDAQAPKS的核苷酸序列间隔。GFP和scFv- MCP-3之间设计Ⅹa因子蛋白酶识别位点，编码的核苷酸序列为 ATCGAAGGTCGG。并在每个相对独立的功能片段前后都设计了限制性内切酶位点，便于基因操作。按重叠延伸PCR（Splicing overlap extension by PCR）引物实验设计原理设计3对引物：VH 5'、VH 3'；VL 5'、VL 3'； MCP-3 5'、 MCP-3 3'。 其中VH 3' 和VL 5'、VL 3' 和MCP-3 5' 为2对用于基因连接的嵌合引物，由linker或spacer的编码序列、与模板的互补序列及限制性酶切位点3部分组成。并且在每对嵌合引物5'端为互补区， 用于重叠延伸PCR 反应。 在VH 5'、 MCP-3 3' 引入与载体接头的SacⅠ和 KpnⅠ限制性内切酶切位点，在MCP-3 3' 引物中引入终止密码子。引物序列见表1。Table 1. Sequences of primers（略）
A20 细胞株的培养
将来源于BALB/c小鼠的B细胞淋巴瘤细胞株A20培养于含10% 的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的高糖DMEM，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，每3-4天传代1次。培养到对数生长期收获细胞。
Ig VH、 Ig VL cDNA扩增
采用TRIZOL RNA提取试剂盒提取细胞内总RNA，用六核随机引物常规方法反转录。以cDNA为模板，以VH0 5′，VH0 3′为引物，选用pfu酶扩增Ig VH cDNA。反应条件: 94℃ 5分钟；94℃ 40秒，61℃ 35秒，72℃ 1分钟，35个循环后72℃ 10分钟。2%琼脂糖电泳检测后切胶回收目的片段。送大连宝生物公司测序。回收物1∶10稀释后作为下步反应的模板。以下模板制备方法相同。Ig VL cDNA片段扩增反应条件相同，扩增产物凝胶电泳检测后回收目的片段，进行测序并制备下步反应模板。
scFv 基因片段的制备
用引物VH 5′和VH 3′、VL 5′和VL 3′分别对IgVH、IgVL cDNA片段进行修饰扩增，反应条件相同，均为： 94℃ 5分钟，94℃ 40秒，63℃ 40秒，72℃ 1分钟，35个循环后72℃ 10分钟。制备模板。用等摩尔数的修饰后的IgVH、 IgVL cDNA为模板，VH 5′和VL 3′为引物，用重组PCR法，制备scFv。反应分两步：第一步，反应体系中未加入引物。反应条件： 94℃ 5分钟；94℃ 1分钟，63℃ 1分钟，72℃ 1分钟，7个循环。 第二步，加入引物VH 5'和V L 3'。反应条件： 94℃ 2分钟；94℃ 1分钟，63℃ 1分钟，72℃ 1分钟，25 个循环后72℃ 10分钟。扩增产物凝胶电泳检测后回收目的片段，进行测序并制备下步反应模板。
MCP-3基因的扩增
以含有MCP-3 基因序列的质粒为模板，分别用引物MCP-3 5' 和MCP-3 3' 扩增MCP-3 基因。反应条件： 94℃ 5分钟；94℃ 40秒，63℃ 35秒，72℃ 1分钟，35个循环；72℃ 10分钟。2%琼脂糖电泳检测后切胶回收目的片段。制备模板用于下步反应。
scFv 与MCP-3融合基因片段的制备与克隆
以等摩尔量的scFv、MCP-3为模板，以VH 5'、MCP 3'为引物，用重组PCR法分两步扩增MCP-3-scFv融合基因片段。反应条件与scFv片段的制备相同。1%琼脂糖电泳检测后切胶回收目的DNA片段。用普通Taq酶在扩增产物的末端加"A"后, 与T载体连接，实验操作按Promega T vector systerm说明书进行，连接产物转化感受态细菌DH5α，PCR及SacⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定阳性克隆，送大连宝生物公司进行测序。筛选出的阳性质粒并命名为pGEM / scFv- MCP-3。
表达质粒的构建与表达
经测序证实的阳性重组质粒pGEM / scFv- MCP-3用SacⅠ、KpnⅠ双酶切后，回收目的基因片段，然后经T4连接酶与同样处理的表达质粒载体pGLo进行连接，转化感受态细菌DH5α，筛选重组克隆并抽提质粒。酶切及PCR鉴定阳性克隆。将重组质粒命名为pGLo / scFv - MCP-3。取单克隆阳性菌的菌液接种于5 ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、200 rpm振荡过夜，按1% 转接于新鲜含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、225 rpm培养至A600 nm = 0.6左右时加入终浓度为0.01%的阿拉伯糖（L-arabinose），30℃诱导4小时。诱导前后菌体制样，10% SDS-PAGE凝胶电泳检测。
结果
基因片段的扩增及测序鉴定
以A20总RNA为模板，经RT-PCR法扩增Ig VH，Ig VL cDNA。 Ig VH cDNA扩增的产物为 403 bp，Ig VL cDNA扩增产物为400 bp左右。测序结果显示Ig VH cDNA 序列与报道［4］完全一致，Ig VH、Ig VL 基因序列翻译成氨基酸序列后与文献［5］报道序列基本一致。Ig VH，Ig VL cDNA电泳结果如图2所示。测序后的Ig VH ，Ig VL cDNA经嵌合引物修饰后长度分别为407 bp、401 bp。以含MCP-3 基因的质粒为模板扩增MCP-3 基因大小为335 bp。经嵌合引物修饰的Ig VH、Ig VL、MCP-3 cDNA电泳图如图2所示。经重叠延伸PCR 获得scFv片段，产物为793 bp，电泳结果如图3所示。测序结果表明，Ig
VH、IgVL 基因连接无误，无碱基突变及移码突变。以scFv和MCP-3为模板，重叠延伸PCR法扩增scFv-MCP-3融合基因片段，产物大小1 111 bp，电泳结果见图3，与T载体连接后挑选阳性的克隆测序，结果表明scFv和MCP-3连接正确，在融合基因的制备扩增过程中，在 Ig VL 序列内第231位核苷酸发生碱基突变A突变成G，其所在的读码框由ACA变为ACG，但均编码Thr，为同义突变，不影响蛋白表达后的氨基酸序列，未予修正。制备的scFv- MCP-3融合基因片段转录成氨基酸序列见图4。
表达载体的酶切鉴定
质粒pGEM/scFv-MCP-3中的融合基因经SacⅠ、KpnⅠ双酶切后，定向亚克隆至表达质粒载体pGLo中。重组表达质粒酶切鉴定图(图5)，说明成功构建重组表达质粒pGLo/scFv-MCP-3。
蛋白质的表达
重组表达质粒pGLo/scFv-MCP-3转染到大肠杆菌DH5α，L-arabinose 30℃诱导4小时后可高效表达融合蛋白GFP-scFv-MCP-3，表达量占菌体蛋白的30%（图6），融合蛋白的大小为65 kD。与预期结果相符。
讨论
选择合适的免疫佐剂增强TAA的免疫原性，是构建肿瘤疫苗的重要因素。在免疫佐剂的选择上，近年来不同实验室进行了多种尝试［6-9］。MCP-3能结合和活化多个趋化因子受体，能够趋化并激活多种免疫细胞尤其是树突状细胞（DC），通过募集DC向抗原注射部位集中，加工处理抗原后，促使DC向成熟型转化，进而转移到引流淋巴结，激活T淋巴胞，启动抗淋巴瘤免疫［10］，它是肿瘤免疫中疗效较好的趋化因子。我们研究中选用将A20细胞表面smIg的scFv片段模拟完整免疫球蛋白的抗原性，与免疫佐剂MCP-3的基因融合，构建pGLo / scFv- MCP-3载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白，制备治疗淋巴瘤的独特型融合蛋白疫苗。构建的载体中，MCP-3的起始处下游设计了BamH I的酶切位点，可通过酶切的方法将MCP-3切出，并换入新的佐剂，进行实验，方便了进一步的实验研究。重叠延伸拼接PCR技术通过设计嵌合引物对2个不同目的序列进行连接［11］。本研究中，应用两次重叠延伸拼接PCR技术，首先制备了小鼠B细胞淋巴瘤细胞膜表面的独特型免疫球蛋白的scFv基因片段；然后，将scFv片段与免疫佐剂MCP-3基因序列通过一段编码NDAQAPKS的spacer序列连接起来。其中spacer序列可以保证scFv和MCP-3蛋白正确折叠并保持各自独立的生物学活性 ［12-14］。 实验中发现，重叠延伸拼接PCR过程中碱基与模板的错配率要明显高于常规PCR反应，即使使用保真性较好的聚合酶也不能避免错配的发生，而可能导致碱基序列的点突变。我们也遇到的Ig VL中第231位核苷酸发生碱基突变A突变成G，使得编码VL序列中第77个氨基酸读码框由ACA变为ACG，但均编码Thr，恰为同义突变。因此一定要使用保真性更高的DNA聚合酶，尽量避免点突变的发生。载体pGLo携带有GFP（绿色荧光蛋白）基因，将scFv- MCP-3融合基因片段插入到GFP下游，转录过程在GFP启动子起始，在MCP-3 下游的终止密码处终止，得到含GFP的融合蛋白。经此改造，蛋白的产量高，并可以利用强阴离子交换剂CaptoTM Q的层析介质纯化含GFP的融合蛋白，提高了生产率及减少工艺循环时间。在GFP下游和VH上游之间预先设计Ⅹa因子蛋白酶识别位点，纯化后的蛋白将用Ⅹa因子蛋白酶切割以获得完整的scFv- MCP-3融合蛋白片段，为下一步生物活性鉴定及作用机制的研究打下基础。
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