T-淋巴瘤细胞的超微结构
作者：茹永新 赵轼轩 刘津华 竺晓凡 秘营昌 肖志坚 邱录贵 王建祥
【摘要】 为了研究T细胞淋巴瘤患者骨髓中恶性T细胞(malignant T cell，MTC)的超微结构，用流式细胞术分析13例T细胞淋巴瘤患者骨髓浸润MTC抗原表达，显微镜观察MTC的形态结构。结果发现：所有患者MTC大小不等，6/13例细胞大小轻度不均，7例显著不均，直径范围在12-28 μm之间。所有患者MTC核异染色质少于正常淋巴细胞，核仁范围在2-8 μm之间；10/13例细胞核不规则。8/13例MTC胞浆丰富；7/13例细胞表面有丰富的突起或伪足。5/13例Golgi体、分泌泡、致密颗粒和微丝较丰富；8/13例MTC线粒体肿胀明显。结论：骨髓MTC体积普遍不均匀增大；细胞核折叠、切迹、扭曲与核旁微丝增加相关。患者MTC表面突起/绒毛与胞浆Golgi体、分泌泡、致密颗粒及中间微丝呈明显同步发育，大部分患者MTC线粒体明显水肿。
【关键词】 超微结构；恶性T细胞；T细胞淋巴瘤；淋巴瘤；骨髓浸润
Ultrastructural Characteristics of Malignant T Cell in T Cell Lymphoma
AbstractIn order to investigate the ultrastructural features of malignant T cell (MTC) in bona marrow aspirate (BMA) from patients with T Cell Lymphoma, the antigen expression of MTC was analyzed by flow cytometry, and the ultrastructural features of MTC in BMA from 13 T-cell lymphoma patients with bone marrow involvement (BMI) were observed by transmission electron microscopy. The results indicated that the sizes of MTC were uneven in every patient and their diameter were between 12 and 28 μm, in 6 out of 13 cases sizes of MTC were slightly uneven but in 7/13 cases sizes of MTC were significantly uneven. The heterochromatin of MTC was less than that of normal T cell and nucleolus diameter was from 2 to 8 μm in all cases. The nuclear contour of MTC was strikingly irregular in 10 out of 13 cases. The MTC had plenty of cytoplasm in 8 out of 13 cases and displayed many microvlli or processes on MTC surface in 7 out of 13 cases, while MTC in 6 out of 13 cases contained more Golgi′ s apparatuses, secretary vacuoles, dense granules and intermediate filaments. In 8 out of 13 cases mitochondria apparently swelled. It is concluded that the size of MTC increase unevenly in all patients. MTC nuclear contour in most cases is irregular by folding, indenting, and twisting, which often correlated with arising of paranuclear intermediate filaments. Processes and microvilli on surface and Golgi＇s apparatus，secretary vesicles, dense granules as well as intermediate filament in cytoplasm of MTC develop synchronously，meanwhile, mitochondria of MTC strikingly swell in most cases.
Key wordsultrastructure; malignant T cell; T-cell lymphoma; lymphoma; bone marrow infiltration
25%-75%的非霍奇金淋巴瘤(NHL)初诊时合并骨髓浸润(bone marrow inflitration, BMI)，外周血和骨髓液中出现淋巴瘤细胞，根据细胞数量多少又分为淋巴瘤骨髓浸润和淋巴瘤细胞白血病［1］。T细胞淋巴瘤发病率低于B细胞,但BMI并发率较高［2］。电子显微镜观察骨髓中恶性细胞的结构不仅有助于淋巴瘤的临床诊断,而且能加深对恶性细胞异常分化的理解。本研究观察13例T细胞淋巴瘤患者骨髓中恶性T细胞(malignant T cell，MTC)的超微结构，现报告如下。
材料与方法
一般资料
13例为初诊患者，男12例，女1例，年龄在1岁-70岁之间。主诉包括发热、乏力、出血、肝脾肿大引起的腹痛和腹胀， 大部分患者淋巴结轻度肿大或肿大不明显。对所有患者进行外周血、骨髓细胞形态、
骨髓病理、细胞流式术和电子显微镜检查，部分经淋巴结或局部病理活检，全部确诊为T细胞性淋巴瘤合并BMI，4例为外周T细胞淋巴瘤（PTCL），1例淋巴母细胞瘤（T-LBL），7例未进一步分型（表1）。Table 1. Clinical characteristics of 13 patients with T-cell lymphoma（略）
电子显微镜标本制备和观察方法
电子显微镜标本制备按照［3］进行日立H-600透射电子显微镜观察。
观察方法观察100个MTC，数目少者，观察最大数。①MTC大小形态（SH）：细胞大小用直径范围（DR）表示。直径差普遍大于4 μm，为细胞大小显著不均, 以“++”表示；最大直径差小于4 μm，为轻度不均，以“+”表示。②表面突起（CP）：分别用“+++”、“++”、“+”表示丰富、较少和稀少。③核质比（NCR）：用核平均直径与细胞平均直径比表示。④核不规则程度（NI）：半数以上MTC核刻痕和切迹深度大于最大直径1/4，或长和短直径比大于2，或细胞核扭曲、多极，为细胞核极度不规则，用“+++”；刻痕和切迹深度大于最长直径1/8小于1/4，为中度不规则，用“++”表示；轮廓为圆形、刻痕或切迹深度小于最长直径1/8，为核轻度不规则，用“＋”表示。⑤异染色质（Hch）：均匀贴附于核膜为含量少，用“+”表示；异染色质在核膜下凝集成块，凸凹不平为“++”；异染色质团块出现于核质中央为“+++”。⑥核仁大小（Nu）：用平均直径表示，多个核仁者以最大核仁算。⑦粗面内质网（RER）、高尔基氏体（GA）、致密颗粒（Gr）、分泌泡（SV）及中间微丝（IF）：半数细胞中有3个/处或以上的为丰富，表示为“+++”；1-2个/处，表示为“++”；未发现者或体积很小，为含量少，用“+”表示。⑧线粒体肿大：半数细胞以上线粒体肿大为广泛肿大，用“+++”表示；半数以下为部分肿大，表示为“++”；否则为无肿大，表示为“－”。
细胞流式术检测
用FACSCalibur流式细胞仪，采用一步法完成［4］，用CD45/ SSC设门［5］，用Cellquest 软件(Becton Dickinson Biosciences).获取细胞和分析结果。MTC阳性抗原判断标准：胞膜抗原阳性细胞率≥20％，胞内抗原阳性细胞率≥10％。
结果
细胞流式术检测
患者骨髓中的异常淋巴细胞表达T系抗原，不表达B系抗原；4例患者骨髓MTC数少于有核细胞的20%，9例骨髓MTC数大于有核细胞的20%（表2）。Table 2. Main antigens expression of MTC in bone marrow by flow cytometry（略）
显微镜观察
细胞大小与核质比13例患者MTC体积大于正常淋巴细胞，直径范围在12-28 μm，各患者骨髓MTC大小不均，7/13例大小轻度不均，大小不同细胞数量比例无明显；6/13例MTC显著不均，一般可见大小明显不同的两类细胞，最大直径28 μm。8/13例MTC胞浆丰富，最小核质比等于或小于1∶2；5/13例细胞核增大，胞浆少，最小核质比大于1∶2（表3）。Table 3. Ultrastructural features of MTC in bone marrow from 13 cases of T-cell lymphoma（略）
细胞表面突起7/13例患者MTC表面有大量突起和绒毛，其中6/7例胞浆丰富，5/7例发现中间微丝。其它6/13例MTC表面突起和绒毛较少，而胞浆和其它细胞器也少，未发现中间微丝，其中2例细胞核圆，呈现低分化结构。MTC表面突起和胞浆及中间微丝量有一定对应关系（附图）。
核与核仁7/13例MTC核极度不规则，可见折叠、多极或扭曲，3/13例核轮廓圆形或卵圆形，为轻度不规则；3/13例细胞核中度不规则。所有患者MTC异染色质少于正常淋巴细胞，3/13例均匀贴附于核膜下，7/13在核膜下凝集成块，凸凹不平，3例异染色质多，团块散在分布于核质。所有患者MTC核仁显著，直径在2-8 μm之间，数目1-3个，核仁与核的大小相应。1例患者MTC直径15 μm，核仁直径达6 μm，细胞器很少，显示高度恶性或未分化结构。
其他细胞器5/13例患者（病例号1、2、5、12、13）MTC的RER、Golgi体发达，同时在胞浆发现较多的分泌泡、致密颗粒和中间微丝；2/13例患者（4,8）除RER较多，其它细胞器少；其他6/13例MTC中RER、Golgi体、分泌泡、中间微丝和致密颗粒都很少发现。8/13例患者MTC线粒体肿大，密度降低，嵴间隙加宽，部分线粒体嵴断裂，而且其它细胞器也比较丰富；5/13例MTC线粒体肿大不明显。
讨论
T细胞淋巴瘤是限制性干/祖细胞分化异常引起的克隆增殖肿瘤，发生部位广泛，涉及多种组织，合并BMI时外周血和骨髓涂片上出现异常细胞，光学显微镜下难以定性，描述为“异常细胞”、“不明细胞”、“单核样细胞”或“组织细胞”，较贴近的描述是“幼稚淋巴或原始淋巴细胞”［6］。电子显微镜观察13例患者骨髓中MTC大小不同，直径在12-28 μm之间，大于正常淋巴细胞范围（6-12 μm）。同一患者MTC的大小也存在明显差别，与光学显微镜观察结果一致［7］。部分MTC的体积大和胞浆增多有关，类似淋巴细胞的激活状态；而部分MTC核增大为主，核质比最高1∶1.2，显示了MTC的高度肿瘤特性。因此， MTC大小不仅与细胞肿瘤特性和分化程度有关，也可能与骨髓环境中的激活状态相关。细胞突起、绒毛或伪足指突出细胞基本轮廓之外的少量胞质，伪足粗大而不规则，突起较短，绒毛细长，这些结构在细胞不同发育阶段有特定功能，也是正常细胞分化和激活的形态标志。电镜下MTC表面突起较多，胞浆和中间微丝也比较丰富，说明表面突起和绒毛形成与胞浆发育和微丝含量有关。核不规则是正常T淋巴细胞的特点，也是多数肿瘤细胞的常见表现。本组7例患者MTC核极度不规则，出现折叠、切迹、扭曲甚至分叶现象，其中5例有核旁微丝(病例号1、3、5、12、13)；另外3例MTC细胞核轻度不规则患者，胞浆中间微丝少见或未见（病例号6、7、10）。这说明MTC核不规则一方面与核酸异常合成有关，另一方面可能与大量微丝对细胞核牵拉或限制有关。正常淋巴细胞通常有一个核仁，轮廓较小，位于核中心；MTC可有2个以上核仁，直径明显大于正常，位置不定。MTC异染色质少于对应正常细胞，胞浆有大量游离核糖体，说明染色质多为解聚状态，DNA复制或转录加强，可能与合成自身结构蛋白满足肿瘤细胞增殖需要相关，这点与正常T细胞显著不同。细胞器是细胞分化程度的重要结构标志，本组5/13例患者RER、Golgi体、胞内微丝、分泌泡和致密颗粒同步发育、与胞浆量增多相应，说明部分患者骨髓MTC有一定分化能力。线粒体是细胞代谢和细胞损伤的风向标，本组8患者MTC的线粒体肿大、密度降低、嵴断裂、间隙加宽，而这些患者的MTC其它细胞器相对丰富，说明MTC分化程度越高和线粒体损伤越明显，在增殖和能量代谢方面存在明显矛盾，病理机制值得深入研究。总之，T细胞淋巴瘤患者骨髓MTC普遍大小不均，细胞分化程度存在一定差异。Golgi体、微丝、分泌泡和致密颗粒等细胞器常常同步发育；表面突起与胞浆量和中间微丝增多相关，核不规则与中间微丝有一定关系。大部分MTC线粒体存在明显损伤。
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4 Francis C, Connelly MC. Rapid single-step method for flow cytometric detection of surface and intracellular antigens using whole blood. Cytometry. 1996; 25: 58-70
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