RHD 1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率研究

        作者：吴俊杰　洪小珍　许先国 马开荣 朱发明 严力行

【摘要】  　　本研究调查RHD 1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率。采用等位基因特异-聚合酶链反应(allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)检测RHD 1227A等位基因， RHD基因拷贝数采用D杂合性试验和RHD外显子9的核苷酸序列分析方法进行确定。结果表明： 在143例Rh阴性献血员中，共检测到41例RHD 1227A等位基因携带者，其中8 例(19.51%)为 RhCCdee，32例 (78.05%) 为RhCcdee，1例 (2.44%) 为 RhCcdEe。在这41例RHD 1227A等位基因携带者中，35例有RHD基因的缺失，另外的6例是RHD 1227A等位基因的纯合子。在489例随机献血员中检测到7例RHD 1227A等位基因先证者，都是RHD 1227G/A杂合子，且是正常Rh阳性血型。结论： RHD 1227A等位基因在Rh阴性人群中的频率为16.43％，在随机人群中的频率为0.72％。

【关键词】  RHD基因； RHD 1227A等位基因； 基因频率； Rh阴性人群

　　　RHD 1227A Allele Frequency among Rh Negative Population and Random Population

　　　AbstractTo investigate the  frequency of RHD 1227A allele  in Rh negative population and random population, an AS - PCR (allele specific - polymerase chain reaction) method was emloyed to detect RHD 1227A allele.  RHD gene copy was determined by   D zygosity test and RHD exon  9 nucleotide sequence analysis. The results showed that among 143 Rh negative donors, forty-one  RHD 1227A  allele carriers  were detected,  and 8 (19.51%) out of which were RhCCdee, 32 (78.05%)  were RhCcdee, and 1 (2.44%) was RhCcdEe. Thirty-five Rh negative RHD 1227A carriers had  RHD gene deletion, and the remaining carriers were RHD 1227A homozygous. Seven (1.43%) individuals were detected with RHD 1227A allele among 489 random donors. They were all G/A heterozygous at RHD 1227 site. Serological test indicated that they were normal Rh positive phenotype. It is concluded that  the frequency of RHD 1227A allele is 16.43％ among Rh negative population and 0.72% among the random population.

　　Key wordsRHD gene； RHD 1227A allele； gene frequency;  Rh negative population

　　在过去的10多年里，RH血型的分子生物学研究有了很大的进展，对D抗原的免疫原性也有了更进一步的认识［1-3］。因为DEL抗原（只有通过吸收释放才能检测到的弱表达D抗原）有可能快速诱发抗D免疫事件［4-6］，如何通过准确的基因分型建立一个真正的RH阴性供者库（目前的RH阴性血型包括DEL表型）和分子鉴定各种D突变体成为输血医学的一个新热点［1，2］。充分了解RHD等位基因的多态性和人群中的频率是RHD基因分型的必要条件［2］。Gassner等［7］和Doescher等［8］研究发现，RHD等位基因即使在相邻地区也可能有很大的差异； Chen等［9］发现，从弱D表型推算得到的基因人群频率和随机人群调查得到的基因人群频率也不尽一致。我们率先用等位基因特异-聚合酶链反应（allele specific - polymerase chain reaction, AS-PCR)方法调查DEL表型的主要等位基因RHD 1227A在Rh阴性人群和随机人群中的频率，并对结果的临床意义作了讨论。

　　材料和方法

　　对象

　　在2003年10月—2004年10月期间在浙江省血液中心献血的无亲缘关系Rh阴性献血员143名作为Rh阴性人群，随机选取在浙江省居住或者工作的无亲缘关系献血员489名作为随机人群。

　　Rh表型血清学鉴定

　　RHD表型鉴定采用常规盐水平板法，使用加拿大Dominion公司的IgM和IgG混合的抗D试剂（人单克隆IgM抗D,D175-2细胞株； 人单克隆IgG抗D， D415 1E4细胞株）。RhC、Rhc、RhE和Rhe鉴定采用盐水试管法，试剂为Dominion公司的相应单克隆抗体。

　　AS-PCR

　　参照［10］进行。用特异扩增RHD 1227A等位基因的引物：  RHDEL－s（上游引物）: GACCAAGTTTTCTGGAAA（位置对应于AJ299028的68-85）、 RHDEL－a（下游引物）: CGAGAGAATTTTGAGCAC （位置对应于AB035185的849-832）。一对特异扩增人生长激素（HGH）基因429 bp的引物作为内对照，HGH-s（上游引物）：  GCCTTCCCAACCATTCCCTTA； HGH-a（下游引物）： TCACGGATTTCTGTTGTGTTT。反应总体积10 μl，含模板DNA 0.2  μl（约含DNA  20-50 ng），特异性引物终浓度250 nmol/L，内对照引物终浓度50 nmol/L，MgCl2 终浓度1.5 mmol/L，dNTP终浓度 200 mmol/L，Taq酶0.2 U（TaKaRa公司产品）。PCR扩增条件： 95℃ 预变性5分钟，然后94℃ 变性30秒、58℃ 退火30秒和72℃ 延伸50秒，循环30次，最后72℃延伸5分钟。产物通过2％琼脂糖电泳，用凝胶成像仪（Syngene公司产品）观察结果。

　　RHD基因外显子9序列分析

　　参照文献［11］进行。用RHD基因外显子9的特异引物， WD9 s（上游引物）: GGTCCAGGAATGACAGGGCT (位置：对应于AB035196的4682-4701)；  WD9 a（下游引物）： CGCTGAGGACTGCAGATAGG (位置：对应于AB035185的294-275)，扩增覆盖外显子9及侧翼序列的532 bp片段。PCR产物用Qiagen公司的胶纯化回收试剂盒纯化，采用BigDye Sequencing kit（ABI公司产品）试剂盒进行测序反应，用ABI PRISM 377测序仪进行PAGE电泳，Sequence Analysis进行数据分析。

　　RHD基因缺失检测

　　根据Perco等［12］的方法，用特异性引物μ1-s（上游引物）和rnb31（下游引物） PCR检测Rhesus hybrid box（AJ252313, 4988-7710区域）。如果可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，则表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失； 反之，则不存在Rhesus hybrid box，没有RHD基因的缺失。

　　结果

　　Rh阴性随机人群中RHD 1227A的人群频率

　　对143例Rh阴性人群的调查发现，RHD 1227A阳性的个体有41例，占Rh阴性人群的28.67％。其中RhCCdee表型8例（19.51％），RhCcdee表型32例（78.05%），RhCcdEe表型1例（2.44％）（附表）。在RhCCdEe、Rhccdee、RhccdEe和RhCcdEE表型的Rh阴性随机人群中未检测到RHD 1227A等位基因。采用Perco等的Rhesus hybrid box检测方法［12］，RHD 1227A阳性的41例Rh阴性人群中有35例可以扩增得到2 778 bp的特异性片段，表明存在Rhesus hybrid box，有RHD基因的缺失；有6例不能扩增到2 778 bp的片段，表明不存在RHD基因的缺失，RHD 外显子9序列分析结果表明，6例都为RHD 1227A等位基因的纯合子，即在我们检测的Rh阴性随机人群中，RHD 1227A等位基因的拷贝数为47，基因频率为16.43％。Table .  Frequency of RHD 1227A allele among random Rh negative popoulation（略）

　　随机人群中RHD 1227A的人群频率

　　在489例随机人群中，检测到7例RHD 1227A阳性个体，占随机人群的1.43％。血清学检测表明，这7例个体都是Rh阳性。外显子9的序列分析表明，这7例个体在1227位都是G和A的杂合子（附图）。用Perco等的方法［12］，该7例RHD 1227A阳性个体均未扩增到2 778 bp的片段，结果也表明不存在RHD基因的缺失。因此，在我们检测的489例随机人群中RHD 1227A等位基因的拷贝数为7，基因频率为0.72％。

　　讨论

　　和欧洲不同，亚洲Rh阴性人群有很高比例的DEL表型。在Gassner等［7］和Wagner等［13］的研究中，发现 DEL个体由RHD 885T（M295I）、RHD 1227A(K409K)、RHD IVS5-38del4、RHD 1252T(Tins)1253A (X418L)和RHDIVS3+1A等位基因引起。在亚洲人群中， DEL表型主要是外显子9缺失和RHD 1227A［14-19］2种。我们前期的研究结果表明，浙江汉族DEL表型是由RHD 1227A等位基因引起［10］，并根据RHD 1227A等位基因的序列设计了DEL表型的AS-PCR基因分型方法［11］。采用该AS-PCR方法，我们在143例Rh阴性人群中检测到41例（28.67％）携带RHD 1227A，其中RHCCdee占19.51％，RHCcdee占78.05%， Rh-CcdEe占2.44%。这些结果和Chen等［14］和Shao等［17］的研究结果基本一致。在489例随机人群中我们发现7例RHD 1227A阳性个体。序列分析发现，这些先证者在RHD基因的1227位都是G和A的杂合子；血清学检测表明，是Rh阳性血型。Rhesus hybrid box检测表明，这7例个体都不存在RHD基因的缺失。结合Rhesus hybrid box检测和RHD基因外显子9的序列分析结果推断的RHD 1227A等位基因的拷贝数和RHD 1227A等位基因携带者在人群中阳性的个体比例，我们推算出RHD 1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的基因频率分别为16.43％和0.72％，和Shao等［14］、Chen等［17］通过Del表型推算的RHD 1227A等位基因在深圳和随机人群中的频率基本一致。 Ishikawa等［20］发现，日本人群中90％的Rh阴性、C阳性和RHD基因阳性的献血员携带RHD 1227A等位基因，而在欧洲人群中，RHD 1227A的基因频率只有1/9 091［13］。由上述分析可见，RHD 1227A等位基因主要在亚洲人群中有意义。另外，我们首次在Rh阳性血型个体中检测到RHD 1227A。这一方面表明RHD 1227A表达的抗原很弱，相对于正常RHD等位基因，DEL抗原不被表现；另一方面，RHD 1227A隐性携带者的子代表现为DEL 表型的要比正常对照高1倍。如果在随机人群中开展RhD血型的基因分型，RHD 1227A等位基因的检测必须和RHD 1227G(正常RHD对照)相结合，即当RHD 1227A阳性、RHD 1227G阴性时，有比较大的可能是DEL，而当RHD 1227A和RHD 1227G都为阳性时很可能是RHD 1227A的隐性携带者、正常D表型。基因分型方法具体实施时还需考虑其它不表达等位基因的突变位点的检测。

【】
  　　1 Flegel WA. Homing in on D antigen immunogenicity. Transfusion, 2005; 45: 466-468

　　2 Avent ND. High variability of the RH locus in different ethnic backgrounds. Transfusion, 2005; 45: 293-294

　　3 Garratty G. Do we need to be more concerned about weak D antigens? Transfusion, 2005; 45:1547-1551

　　4 Wagner TW, Kormoczi GF, Buchta C, et al. Anti-D immunization by DEL red blood cells. Transfusion, 2005; 45: 520-526

　　5 Yasuda H, Ohto H, Sakuma S, et al. Secondary anti-D immunization by Del red blood cells. Transfusion, 2005; 45: 1581-1584

　　6 Kormoczi GF, Gassner C, Shao CP, et al. A comprehensive analysis of DEL types: partial DEL individuals are prone to anti-D alloimmunization. Transfusion, 2005; 45: 1561-1567

　　7 Gassner C, Doescher A, Drnovsek TD, et al. Presence of RHD in serologically D-, C/E+ individuals: a European multicenter study. Transfusion, 2005; 45:527-538

　　8 Doescher A, Flegel WA, Petershofen EK, et al. Weak D type 1.1 exemplifies another complexity in weak D genotying. Transfusion, 2005; 45: 1568-1573

　　9 Chen Q, Flegel WA. Random survey for RHD alleles among D+ European persons. Transfusion, 2005; 45: 1183-1191

　　10 吴俊杰，洪小珍，马开荣等. 浙江汉族DEL表型基因分型方法的建立. 实验血液学杂志，2006；14：1017-1019

　　11 吴俊杰，洪小珍，许先国等. 中国人Rh部分D表型的分子机理研究. 中国实验血液学杂志，2006； 14：587-591

　　12 Perco P, Shao CP, Mayr WR, et al. Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered Rhesus boxes and a new weak D type. Transfusion， 2003; 43: 335-339

　　13 Wagner FF, Frohmajer A, Flegel WA. RHD positive haplotypes in D negative Europeans. BMC Genet, 2001； 2:10

　　14 Chen JC, Lin TM, Chen YL, et al. RHD 1227A is an important genetic marker for RhD(el) individuals. Am J Clin Pathol, 2004; 122: 193-198

　　15 Lee YL, Chiou HL, Hu SN, et al. Analysis of RHD genes in Taiwanese RHD-negative donors by the multiplex PCR method. J Clin Lab Anal, 2003; 17:80-84

　　16 Chang JG, Wang JC, Yang TY, et al. Human RhDel is caused by a deletion of 1,013 bp between introns 8 and 9 including exon 9 of RHD gene. Blood,1998; 92:2602-2604

　　17 Shao CP, Maas JH, Su YQ, et al. Molecular background of Rh D-positive, D-negative, D(el) and weak D phenotypes in Chinese. Vox Sang, 2002; 83:156-161

　　18 邵超鹏，何春辉. RHD基因3'-非编码区序列分析. 中国实验血液杂志，2005； 13：219-221

　　19 王晓珠，兰炯采，吴绪华等. Rh弱D及Del样本的检测研究. 中国实验血液学杂志， 2005； 13: 509-511

　　20 Ishikawa H, Tsuneyama H, Uchikawa M, et al. The Rh Del allele in the Japanese (in Japanese). Jpn J Trans Med, 2004; 50: 710-713