血浆炎性趋化因子CXCL9/Mig水平与急性移植物抗宿主病关系的研究

           作者：冀林华　任汉云　石永进　岑溪南　邱志祥　欧晋平　许蔚林

【摘要】  　　研究血浆炎性趋化因子CXCL9/Mig在异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）前后的水平变化，以探讨该因子在急性移植物抗宿主病（aGVHD）发病中的作用。以35例异基因造血干细胞移植患者为研究对象，其中包括发生0-Ⅰ度aGVHD者13例，Ⅱ度aGVHD者12例，Ⅲ-Ⅳ度aGVHD者10例。采用固相双抗体夹心ELISA 方法分别测定造血干细胞移植前、临床aGVHD发生前1周、aGVHD高峰时、aGVHD完全控制后血浆CXCL9/Mig水平。结果表明：中、重度aGVHD（Ⅱ-Ⅳ度）发生时血浆CXCL9/Mig水平明显升高( P<0.001)，且随aGVHD严重程度加重而增加；临床aGVHD表现出现前1周，血浆CXCL9/Mig水平已明显升高( P<0.001)。血浆CXCL9/Mig水平与巨细胞病毒（CMV）感染等感染并发症无明显相关性（P＞0.05）。结论： CXCL9/Mig血浆水平与aGVHD的发生明显相关，表明该因子在aGVHD发生中发挥重要作用。异基因造血干细胞移植后动态观察血浆CXCL9/Mig水平变化可作为aGVHD早期诊断的有价值的指标，进而达到早期干预aGVHD提高异基因造血干细胞移植效果的目的。

【关键词】  急性移植物抗宿主病;炎性趋化因子；CXCL9/Mig；异基因造血干细胞移植

　　Increment  of Chemokine CXCL9/Mig in Plasma Correlated with Acute Graft-versus-Host Disease after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation

　　　AbstractTo investigate the relationship between the plasma levels of chemokine CXCL9/Mig and acute graft-versus-host disease (aGVHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation（allo-HSCT）.The plasma levels of CXCL9/Mig of 35 patients who received all-HSCT were detected by using ELISA assay，these patients included 13  patients with grade 0-Ⅰ，12 patients with grade Ⅱ and 10 patients with grade Ⅲ-Ⅳ aGVHD，respectively. The four different  time points including prior to allo-HSCT, one week before aGVHD onset, the plateau of aGVHD and  time after completely controlled, were studied. The results showed that the plasma levels of CXCL9/Mig in the patients with serious aGVHD(grade Ⅱ-Ⅳ) were significantly increased during aGVHD than those in the patients without aGVHD or with slight aGVHD (P<0.001). It was found that CXCL9/Mig levels were significantly correlated with the severity of grade aGVHD (P<0.001). Another important finding was that CXCL9/Mig levels obviously  increased at one week before aGVHD was diagnosed. CXCL9/Mig level was not obviously correlated with CMV infection or other infectious complication（P＞0.05）.  It is concluded that the plasma level of CXC19/Mig significantly correlated with the severity of aGVHD and plays a critical role in pathogenesis of aGVHD, the changes in plasma level of CXCL9/Mig after allo-HSCT may be used as a valuable indicator for early diagnosis of aGVHD, finally,  provide  a early therapeutic approach to reduce aGVHD severity and improve the outcome for patients after allo-HSCT.

　　Key wordsacute graft-versus-host disease; chemokine; CXCL9/Mig; allo-HSCT

　　急性移植物抗宿主病（acute graft-versus-host disease ，aGVHD）是异基因造血干细胞移植中最常见并发症之一，严重影响着异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）的临床疗效。aGVHD发生的关键之一是活化T细胞入侵靶器官，释放细胞因子及穿孔素、颗粒酶等造成组织器官损伤［1］。 炎性趋化因子CXCL9/Mig（monokine induced by INF-γ，Mig）在趋化活化T细胞进入aGVHD靶器官中起着重要作用［2］。我们对aGVHD发生前后血浆中炎性趋化因子CXCL9/Mig的水平进行了研究，以期了解患者血浆CXCL9/Mig水平与aGVHD发生及其严重程度间的关系，探讨CXCL9/Mig在aGVHD发病中的作用，为aGVHD的早期诊断和早期干预提供依据。

　　病例和方法

　　病例

　　选取2003年12月至2005年11月在北京大学第一进行异基因造血干细胞移植的部分患者为研究对象，共35例，其中亲缘移植26例，非亲缘移植9例；HLA配型3/6位点相合2例（6%），4/6相合11例（31%），5/6相合7例（20%），6/6相合15例（43%）。预处理方案采用改良的Bu/Cy方案：移植前10天至9天Ara-C 4 g/m2，；移植前8至6天Bu 4 mg/kg；移植前5至4天CTX 1.8 g/m2,移植前3天甲基环己亚硝脲250 mg/m2；非亲缘及HLA配型不全相合移植患者加用抗人胸腺细胞球蛋白（ATG） ，移植前5至2天2.5 mg/kg。CTX用药期间大量水化、碱化并强行利尿。GVHD预防：采用经典环孢菌素A（3 mg/kg,移植前7天起）+短疗程甲氨喋呤(MTX 15 mg/m2,移植后1天即+1天起；10 mg/m2，移植后3，5，11天)方案，多数患者加用霉酚酸酯（MMF），移植前9天至移植后30天，1 g/d。按照美国Fred Hutchinson癌症研究所诊断标准［3］对GVHD进行分度。所发生的aGVHD按临床情况分为3组:第1组为未发生或发生Ⅰ度aGVHD的患者，共13例,年龄11-43岁,平均(26±9)岁;第2组为发生Ⅱ度aGVHD的患者，12例，年龄6-52岁,平均(26±12)岁;第3组为Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者,10例,年龄6-51岁,平均(31±9)岁。3组研究对象的年龄、性别差异无统计学意义。对Ⅱ度及Ⅱ度以上aGVHD治疗加用甲基强的松龙1-2  mg/（kg·d），在症状控制后逐渐减量；若激素治疗效果不显，加用人源化CD25单克隆抗体1 mg/kg，分别于1、4、8、15、22日应用或加用甲氨喋呤等其他免疫抑制剂治疗。

　　标本采集

　　于造血干细胞移植前后每周留取血液标本。采清晨空腹静脉血5 ml，EDTA抗凝, 于普通离心机1 000×g离心15分钟，分离血浆后-86℃冻存。分别选取造血干细胞移植前、出现临床aGVHD表现前1周、aGVHD发生高峰时和aGVHD完全控制时的血浆标本用于实验，其中无GVHD者选取平均GVHD好发高峰时间血浆标本（约移植后30天左右）。

　　血浆CXCL9/Mig的检测

　　采用双抗体夹心ELISA方法,试剂盒购自美国R&D Systems公司。实验前将试剂、样本室温平衡2小时，预先向各反应孔（96孔板）加入100 μl测定稀释液。然后将配好的标准品和待测血浆各100 μl加入相应反应孔，封闭孔板，室温下孵育2小时。洗板4次，每孔依次加入200 μl  CXCL9/Mig结合物（二抗），封板，室温下孵育2小时。洗板4次，每孔依次加入200 μl底物溶液，室温下避光反应30分钟。每孔依次加入50 μl终止液，30分钟内在酶标仪上读取OD450，570值。以ASCSW26软件包分析数据，得出各样本CXCL9/Mig浓度值。

　　统计学方法

　　应用SPSS 10.0 软件分析数据,结果以X±SD表示。各组间比较采用方差分析,以P<0.05为具有统计意义。用偏相关分析,分析血浆CXCL9/Mig水平与CMV等感染的活动性炎症的相关性。

　　结果

　　各组患者血浆CXCL9/Mig水平测定结果

　　造血干细胞移植前，临床GVHD出现前1周，aGVHD高峰时及GVHD完全控制后各组血浆CXCL9/Mig水平结果见附表。患者在移植前血浆CXCL9/Mig水平均处于低水平，各组间无显著性差异。发生aGVHD时血浆CXCL9/Mig水平升高，且随着aGVHD严重程度的加重而升高。对于0-Ⅰ度aGVHD患者，移植后血浆CXCL9/Mig水平只有轻度升高（1-2倍）；Ⅱ度aGVHD患者在GVHD发生前已有明显升高，平均升高约3倍，aGVHD高峰期进一步升高，平均升高约6倍；对于Ⅲ-Ⅳ度aGVHD患者在GVHD前1周已平均升高5倍，GVHD高峰时CXCL9/Mig水平升高约13倍。Table.  Plasma levels of Chemokine CXCL9/Mig (pg/mL) at different stages of aGVHD（略）

　　Ⅱ度和Ⅲ-Ⅳ度aGVHD组在临床aGVHD表现出现前1周血浆CXCL9/Mig水平即明显升高，与0-Ⅰ度aGVHD组相比差异显著(P<0.001)，且出现aGVHD 1周前Ⅱ度aGVHD组与Ⅲ-Ⅳ度aGVHD组相比,差异也有统计学意义（P<0.01）(图1，2)。

　　血浆CXCL9/Mig水平与效果相关

　　Ⅱ度aGVHD患者经积极治疗，aGVHD均得到完全控制(100%),达到完全控制的平均时间为（21.5±3）天;Ⅲ-Ⅳ度aGVHD组中只有5例达到疾病完全控制（50%），达到完全控制的平均时间为（39.2±10）天，两组达到完全控制的时间之间有着显著性差异（P<0.01）。而GVHD发生时血浆CXCL9/Mig水平在Ⅲ-Ⅳ度aGVHD组中疾病控制者为(1061.5±131)pg/ml,未控制者为(1877.6±672)pg/ml,两者间也存在显著差异（P<0.05）。这些结果提示血浆CXCL9/Mig升高水平越高，GVHD控制难度越大。

　　血浆CXCL9/Mig水平与感染并发症的关系

　　0-Ⅰ度aGVHD组中在研究期间有7例患者合并CMV病毒血症（55%），血CMV拷贝数达104/ml以上，与无病毒血症者相比较血浆CXCL9/Mig水平无统计学差异（P＞0.05）。Ⅱ度aGVHD组中5例并CMV血症（42%），与无病毒血症者相比较血浆CXCL9/Mig水平亦无统计学差异（P＞0.05）。Ⅲ-Ⅳ度aGVHD组CMV血症者占90%，出现时间多在aGVHD之后（80%），说明血浆CXCL9/Mig水平升高与CMV感染无明显相关性。其中Ⅰ度aGVHD中1例患者合并EB病毒血症，其血浆CXCL9/Mig水平在感染期间无明显升高。另外，在研究期间发现0-Ⅰ度aGVHD组中合并细菌感染性败血症者2例，两例患者血浆CXCL9/Mig水平与无败血症者相比无明显差异（P＞0.05）；Ⅱ度aGVHD组中3例合并细菌感染性败血症，与同组无败血症者相比血浆CXCL9/Mig水平也无明显差异（P＞0.05）。Ⅱ度aGVHD组中合并肺曲霉菌感染者1例，血浆CXCL9/Mig水平与同组其他患者相比无明显变化。

　　讨论

　　我们研究发现血浆趋化性细胞因子CXCL9/Mig水平在中重度aGVHD发病过程中显著升高，与aGVHD的严重程度呈正相关，提示CXCL9/Mig在aGVHD发病中起重要作用。aGVHD是由供者来源的T淋巴细胞造成宿主靶器官损伤。Sackstein［4］提出GVHD发生的一个必需条件就是活化T细胞向靶器官的浸润。趋化性细胞因子（chemokines, chemoattractant cytokines）控制着这一活动。动物实验证明，当受者接受大剂量放/化疗的预处理后，输入异基因骨髓或外周血干细胞（包含T淋巴细胞）。在回输后的最初数个小时，T细胞聚集于周围淋巴组织，在异体抗原的刺激下活化增殖，产生Th1效应细胞，并产生INF-γ及TNF-α等细胞因子。这些细胞因子可进入GVHD靶器官，与预处理所致组织损伤产生的细胞因子协同作用，诱导抗原提呈细胞、内皮细胞等产生趋化性细胞因子，其中最早诱导产生的趋化因子即为CXCL9/Mig。MHC不合动物移植模型显示，移植后3天内淋巴组织多种趋化因子包括CXCL9/Mig表达上调，而aGVHD靶组织内CXCL9/ Mig表达先于其他趋化因子的表达［2］。CXCL9/Mig的产生是aGVHD发生的一个必要条件。因为CXCL9/Mig的受体为CXCR3，主要表达于Th1细胞，CXCR3可作为活化Th1淋巴细胞的一个标志［5-7］。
　　CXCL9/Mig与其它早期反应趋化因子CXCL10、CXCL11在GVHD靶器官中表达增加,就会趋化CXCR3+ Th1细胞迁移至相应靶组织,造成组织损伤［8-10］。血浆CXCL9/Mig水平升高程度与aGVHD的严重程度相关，提示CXCL9/Mig水平越高，GVHD靶器官淋巴细胞浸润越严重，对判断疾病严重程度、疗效及预后有指导意义。血浆CXCL9/Mig水平在临床aGVHD诊断前已明显升高，因此动态监测CXCL9/Mig水平变化可作为一个早期诊断和预测aGVHD严重程度的有用指标。我们对Ⅲ-Ⅳ度aGVHD组中治疗有效者5例（5/10）与治疗无效者5例（5/10）进行了对比，发现aGVHD控制组与未控制组后期(控制组在达到完全控制的平均时间约39天以后，未控制组在aGVHD发生30天以后)血浆CXCL9/Mig均明显下降，说明CXCL9/Mig在疾病早期趋化活化T细胞进入GVHD靶器官中起重要作用，而在启动GVHD后不再发挥作用。这一现象在动物实验中得到证实。Ichiba等［11］以异基因骨髓移植小鼠为研究对象，用寡核苷酸微阵列法研究肝脏GVHD时基因表达的情况，发现早期CXCL9/Mig基因表达明显上调，而在移植后35天时表达已降至正常。这同样说明CXCL9/Mig在疾病早期起重要作用。CXCL9/Mig基因表达在aGVHD后期下调的原因有待进一步研究。与此同时，我们对研究期间合并细菌、病毒感染时CXCL9/Mig表达的情况进行了分析，结果发现CMV病毒感染时血浆CXCL9/Mig有轻度升高，但无统计学意义。合并细菌败血症或真菌感染等时，血浆CXCL9/Mig变化亦无统计学意义，排除了感染造成CXCL9/Mig升高的可能性。这是因为在正常和炎症活动中趋化性细胞因子调节特定白细胞群的定向移动,不同趋化因子控制不同白细胞群的移动［12］，而CXCL9/Mig配受体对主要出现在TH1细胞为主的免疫反应中，对中性粒细胞无趋化效应，不出现在以中性粒细胞反应为主体的炎症反应中［13］。CXCL9/Mig 在 GVHD 中的作用尚有可能作为治疗靶点， 干预 aGVHD 发生。 对鼠的骨髓移植研究显示干扰 T 淋巴细胞的迁移能达到减少 aGVHD 而保留 GVL 效应的有效治疗目的［2,14］。 MHC Ⅱ 类抗原不相合的异体皮肤移植中应用针对 CXCL9/Mig 的中和抗体, 可以完全阻断宿主 T 细胞向移植物的迁移以及相继发生的排异反应［15］。 因此, 对 allo-HSCT 中 CXCL9/Mig 的研究有广泛的应用前景。

【】
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