异基因造血干细胞移植后人类疱疹病毒6型感染及其与巨细胞病毒感染的相关性
作者：王立茹 董陆佳 陆道培
【摘要】 为了解人类疱疹病毒6型（human herpesvirus 6, HHV-6）在接受异基因造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）的人群中感染现状及其与巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）感染的相关性，对72例接受HSCT的患者HHV-6 DNA血症进行连续监测。收集HSCT患者移植前和移植后1-12周EDTA抗凝的外周血标本共680份，采用巢式聚合酶链反应检测外周血单个核细胞中HHV-6 DNA，并利用Hind Ⅲ 限制性内切酶对HHV-6进行基因分型，同时采用免疫荧光法检测CMV抗原血症。结果显示，HSCT后62.5%（45/72）的患者至少1次出现HHV-6 DNA血症，首次检出的中位时间为14（7-63）天；除1例患者检出HHV-6A型以外，其余所有HHV-6阳性患者均为HHV-6B型感染。65.3%（47/72）的移植后患者至少1次发生CMV抗原血症，首次检出的中位时间为43（14-105）天。HHV-6与CMV共感染（CMV+/HHV-6+）的发生率为52.8%（38/72）。HHV-6 DNA血症的首次检出时间早于CMV抗原血症（P<0.0001）。HHV-6 DNA血症阳性患者CMV抗原血症检出率显著高于HHV-6血症阴性患者［84.4% (38/45) vs 33.3% (9/27), P=0.0001］。HSCT后的疱疹病毒感染相关疾病中出血性膀胱炎（HC）发生率较高［23.6% (17/72)］，其中88.2%（15/17）的HC发生于HHV-6血症阳性患者，82.3%（14/17）发生于CMV+/HHV-6+患者。结论：HSCT后HHV-6感染以及HHV-6与CMV共感染状态普遍存在，且发生于移植后早期的HHV-6感染与发生时间相对较晚的CMV感染之间可能存在相关性。
【关键词】 造血干细胞移植；人类疱疹病毒6型；巨细胞病毒
Prevalence of Human Herpesvirus-6 in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant Recipients in Correlation with Cytomegalovirus Infection
Abstract In order to study the prevalence of human herpesvirus 6 (HHV-6) in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (allo-HSCT) recipients in China and to analyze the relationship between HHV-6 and cytomegalovirus (CMV) infection in post-HSCT patients, nested polymerase chain reaction (PCR) was used to monitor HHV-6 DNAemia in 72 consecutive allo-HSCT recipients. 680 EDTA anticoagulated peripheral blood specimens were gathered before HSCT or weekly until 12 weeks after allo-HSCT. The variants of HHV-6 were identified by Hind Ⅲ restriction analysis. CMV-pp65 antigenemia was detected by immunofluresence stain. The results showed that HHV-6 DNAemia was detected at least once in 62.5% (45/72) of the patients on the median day 14 (range, 7-63 days) after allo-HSCT, and HHV-6B was the predominant variant. CMV antigenemia was detected at least once in 65.3% (47/72) of the patients on the median day 43 (range, 14-105 days) after allo-HSCT. Co-infection of HHV-6 and CMV (HHV-6+/CMV+) occurred in 52.8% (38/72) recipients. The onset of HHV-6 DNAemia was earlier than that of CMV antigenemia (P<0.0001). Patients with HHV-6 DNAemia positive were more likely to have concurrent CMV antigenemia than HHV-6 DNAemia negative patients (84.4% vs 33.3%, P=0.0001) after allo-HSCT. Among the herpesvirus related disease, the relatively high incidence of hemorrhage cystitis (HC) occurred in 23.6% (17/72) of post-HSCT patients. 88.2% (15/17) of HC developed in HHV-6 positive patients，and 82.3% (14/17) occurred in CMV+/HHV-6+ patients. It is concluded that infection of HHV-6, co-infection of HHV-6 and CMV, commonly occurred in post-HSCT patients in China, HHV-6 infection closely related to CMV antigenemia.
Key wordshematopoietic stem cell transplantation; human herpesvirus 6; cytomegalovirus
人类疱疹病毒6型（human herpesvirus 6, HHV-6）与巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）同属于β疱疹病毒亚家族。根据基因组多态性，HHV-6可以分为A、B两个变异型，其中以HHV-6B型最为常见，其原发感染多见于2岁以内的儿童，是幼儿急疹的主要原因，在2岁以上人群中的血清抗体检出率达到90%以上［1］。HHV-6以CD46分子为受体感染细胞［2］，由于CD46广泛分布于唾液腺、淋巴组织、血管系统、肾脏以及中枢神经系统的神经胶质细胞，在HHV-6宿主细胞范围内分布也相对广泛。除了主要对CD4+T细胞具有亲嗜性以外［3］，HHV-6还对单核细胞、唾液腺细胞、NK细胞、脑组织的少突胶质细胞、星状细胞［4］等具有亲嗜性。与疱疹病毒家族的其他成员相同，原发感染后HHV-6在宿主体内长期处于潜伏状态，当宿主免疫被抑制后，如造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT），体内潜伏的HHV-6可以再活化。大量研究结果提示，CMV感染及其合并症是影响HSCT患者预后的重要原因，因此临床上对移植后CMV感染的防治相当重视，但是HHV-6的研究较短，对其在HSCT患者体内的致病过程尚未得到足够认识。新近国外报道，HSCT后40%-50％患者出现HHV-6感染［5］，与HSCT后中枢神经系统合并症［6］、间质性肺炎［7］、骨髓抑制［8］等的发生可能存在相关性。HHV-6与CMV在基因序列上有高度同源性，因而在生物学特性方面也存在很多共性。Razonable等［9］发现在实体器官移植中，常常发生HHV-6与CMV同时感染。Chapenko等［10］认为，与HHV-6同源性更近的另一β疱疹病毒家族成员HHV-7和CMV共感染是增加肾移植患者“CMV病”发生率的危险因素。HSCT后HHV-6感染及其与CMV感染的关系国内尚无相关报道。本研究应用巢式聚合酶链反应（ nested PCR）和免疫荧光法分别监测HSCT后HHV-6和CMV感染，并分析HHV-6感染与CMV感染以及疱疹病毒感染相关疾病的关系。
材料和方法
患者特征及样本采集
2004年5月至2005年6月接受HSCT的患者共72例。收集患者移植前和移植后1-12周EDTA抗凝的外周血样本共680份。患者特征为：男性41例，女性31例，中位年龄27.5（8-58）岁；急性髓性白血病19例，急性淋巴细胞白血病16例，慢性粒细胞白血病22例，非霍奇金淋巴瘤6例，骨髓增生异常综合征4例，再生障碍性贫血2例，急性早幼粒细胞白血病、多发性骨髓瘤和急性混合细胞白血病各1例。HLA配型相合亲缘供者HSCT 25例，HLA配型相合非血缘HSCT 4例，HLA部分相合亲缘供者HSCT 43例。对HLA配型相合亲缘供者HSCT患者给予马利兰加环磷酰胺为主的改良BU/CY方案或分次全身照射加环磷酰胺方案预处理；非血缘或HLA部分相合HSCT患者给予含抗胸腺细胞球蛋白的预处理方案。移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD）预防方案为环孢菌素A、霉酚酸酯联合短疗程氨甲喋呤。所有患者在预处理期间静脉应用更昔洛韦（GCV）5 mg/kg，每12小时1次，移植当天至移植60天以后每天给予阿昔洛韦（ACV）0.8 g，预防病毒感染。对CMV抗原血症阳性或出现间质性肺炎、出血性膀胱炎（hemorrhagic cystitis, HC）和胃肠炎等疱疹病毒感染相关疾病的患者给予更昔洛韦（GCV）或磷甲酸（PFA）干预性。治疗急性GVHD主要应用糖皮质激素。将采集的外周血样本经裂解红细胞后获得外周血单个核细胞，应用全血基因组DNA提取试剂盒（北京天为时代公司产品）提取基因组DNA，用紫外分光光度计（TU-1901型，北京谱析通用仪器有限公司产品）测定DNA浓度，然后-40℃保存。
HHV-6 DNA血症的巢式PCR检测
巢式PCR引物［11］扩增HHV-6 U31基因片段。HHV-6外引物序列：5′-TTAACGGTCGCGTTCTA ACC-3′ ，和5′-ACGCCTCGTTGAATACTTCG-3，扩增产物为1 216 bp片段；内引物序列：5′-AAGAAGG CTATCACTTAGACACGG-3′ 和5′-TTAGGATAAG AAGCTCGGCG-3′，扩增产物为492 bp片段。PCR反应体系为50 μl，含10×PCR buffer (Mg2+)，2.5 mol/L dNTP，10 μmol/L上、下游引物，1.25 U r-Taq DNA聚合酶（大连宝生物公司产品），100 ng模板DNA。第一轮PCR反应条件：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸60秒；35个循环后72℃后延伸7分钟。第二轮PCR反应条件：以2 μl第一次反应产物为模板，反应条件同第一次反应。扩增产物2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下检测。每一次巢式PCR反应均设立不含模板的阴性对照，同时以含有HHV-6目的片段的质粒为阳性对照。
阳性标准品构建和巢式PCR反应敏感性检测
将巢式PCR第一次反应扩增阳性片段回收后与PMD-18载体连接，转化DH5α感受态大肠杆菌，经菌液PCR和质粒酶切双重鉴定的含有目的片段的菌液送北京诺赛基因中心测序，序列与GenBank公布序列一致，则将所提取的质粒作为本实验的阳性标准品。将阳性标准品由高浓度108/μl至101/μl依次10倍稀释后，继续稀释至5 copies/μl和1 copy/μl，取1 μl作为PCR模板检测PCR反应的敏感性。
限制性酶切HHV-6 PCR产物分型
HHV-6B型PCR扩增产物片段上含有Hind Ⅲ 酶切位点，可以产生370和122 bp的两个片段，HHV-6A型扩增产物片段上则不含Hind Ⅲ 酶切位点。酶切反应体系20 μl，含HHV-6阳性PCR产物4 μl，Hind Ⅲ 内切酶（大连宝生物公司产品）5 U，37℃酶切1小时后，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，鉴定HHV-6的分型。
CMV抗原血症检测
分离EDTA抗凝的外周血中单个核细胞，将细胞浓度调整至浓度为106/ml，离心涂片，每张玻片含105个单个核细胞。采用CMV BriteTM试剂盒（荷兰IQ公司产品）进行免疫荧光标记，通过间接免疫荧光法检测CMV pp65阳性率，每张玻片CMV pp65阳性细胞≥1判定为阳性结果。
统计学分析
数据采用SPSS 11.5软件包处理，HHV-6与CMV感染累积发生率采用Log-rank检验比较，感染发生的时间采用Mann-Whitny U检验比较，以P<0.05为显著性检验标准。
结果
巢式PCR特异性和敏感性
PCR阳性片段与载体连接后构建的质粒，经测序与GenBank HHV-6标准株U31基因序列一致，因此该质粒可以作为巢式PCR扩增HHV-6 U31基因片段的标准品。本实验所选引物序列经过与GenBank中序列对比发现，它只特异性扩增HHV-6 DNA，对其他疱疹病毒DNA无交叉扩增作用。以系列稀释的质粒作为模板，检测PCR扩增HHV-6 U31基因的敏感性是5个基因组拷贝。
移植前、后HHV-6血症及移植后CMV血症的累积发生率
HHV-6 DNA检出率移植前患者中为11.1%（8/72），而移植后患者中为62.5%（45/72）。这些患者至少1次出现HHV-6 DNA血症阳性（图1），首次检出的中位时间为14（7-63）天。经Hind Ⅲ 酶切鉴定，除1例患者的3份样本检出HHV-6A型以外，其余HHV-6感染患者皆为HHV-6B型（图2）。移植后65.3%（47/72）的患者至少1次出现CMV抗原血症（图1），首次检出的中位时间为43（14-105）天。移植后HHV-6 DNA血症和CMV抗原血症随时间的动态演变见图3，HHV-6 DNA血症在移植后2-7周维持较高水平，其中移植后4周阳性率最高（40%），CMV抗原血症的在移植后6-8周较高，以移植后6周最高（25%）。
移植后HHV-6与CMV感染的相关性
移植后HHV-6 DNA血症发生的时间显著早于CMV抗原血症（P<0.0001）。移植后HHV-6 DNA血症阳性患者中CMV抗原血症检出率为84.4%（38/45），显著高于HHV-6 DNA血症阴性患者CMV抗原血症检出率33.3%（9/27）（P＝0.0001)(图4）。
HHV-6、CMV感染与疱疹病毒感染相关性疾病
移植后7例患者出现间质性肺炎，其中3例既存在CMV感染，又有HHV-6感染，有3例只有CMV感染，1例只有HHV-6感染。3例患者发生移植后胃肠炎，此3例患者均检出CMV抗原，1例患者存在HHV-6感染。由于间质性肺炎和胃肠炎的发生率低，无法进行统计学分析。72例患者中17例（23.6%）患者发生HC，88.2%（15/17）发生于HHV-6或CMV血症阳性患者，其中HHV-6血症阳性患者HC累积发生率为33.3%（15/45），显著高于HHV-6阴性患者 ［7.4% (2/27)］(P＝0.0136)；CMV血症阳性患者HC发生率31.9%（15/47），显著高于CMV阴性患者［8.0% (2/25)］(P＝0.0269)。
HHV-6与CMV双重感染状态分析
移植后HHV-6 DNA血症和CMV抗原血症均阳性（CMV+/HHV-6+）、CMV阳性HHV-6阴性（CMV+/HHV-6-）、CMV阴性HHV-6阳性（CMV-/HHV-6+）和CMV与HHV-6均阴性（CMV-/HHV-6-）的发生率分别为52.8%（38/72），12.5%（9/72），9.7%（7/72）和25%（18/72）。分析疱疹病毒感染相关疾病中发生率较高的HC与HHV-6和CMV双重感染状态的关系，82.3%（14/17）的HC发生于CMV+/HHV-6+患者，HC发生率在CMV+/HHV-6+组显著高于CMV+/HHV-6-、CMV-/ HHV-6+和CMV-/ HHV-6-各组［分别为36.8%（14/38），11.1%（1/9），14.3%（1/7）和5.6%（1/18），P=0.047］。
供、受者CMV血清学状态与移植后CMV抗原血症相关性
本研究72例患者中共获得53对供、受者CMV的血清学资料，其中供、受者CMV血清学均阳性（D+/R+）39对，移植后27（69.2%）例受者CMV抗原血症阳性；供者阴性受者阳性（D-/R+）4对，移植后受者全部出现CMV血症；供、受者均阴性（D-/R-）10对，移植后3例受者CMV血症阳性；研究对象中无供者阳性、受者阴性（D＋/R-）的供受者对。供、受者一方或双方CMV血清学阳性组（D+/R+和D-/R+）移植后CMV抗原血症发生率显著高于D-/R-组 ［72.1% (31/43) 和30% (3/10)，P＝0.0326］。
抗病毒对HHV-6 DNA血症的影响
72例患者中，CMV+/HHV-6+38例，其中17（44.7%）例在CMV抗原血症经GCV和PFA治疗后CMV感染缓解的同时HHV-6 DNA血症转阴，6例（13.3%）治疗后仍存在HHV-6 DNA血症，2例（5.3%）未经治疗自行转阴，4例（10.6%）未接受抗病毒治疗而病毒持续阳性，其余9例患者因出院或死亡无法评价。7例HHV-6 DNA阳性、CMV-pp65阴性患者未接受抗病毒治疗，HHV-6 DNA持续或间断阳性。
讨论
本研究采用巢式PCR方法连续监测72例allo-HSCT后患者HHV-6感染，了解HHV-6在大陆HSCT人群中的流行状况，并对HHV-6感染与CMV抗原血症的相关性以及二者双重感染状态进行了分析。结果发现：①HSCT后HHV-6感染以及HHV-6与CMV双重感染较为普遍；②HHV-6感染发生的时间相对早于CMV血症，HHV-6血症阳性患者CMV血症发生率增加；③HHV-6感染，HHV-6和CMV共感染与HC的累积发生率有显著相关性。原发感染后以静止或低拷贝复制的形式在体内潜伏是人类疱疹病毒的共性，这种潜伏感染的特性决定了机体在免疫抑制状态易发生HHV-6和CMV再活化。本实验中患者移植前HHV-6 DNA检出率仅为11.1%，说明移植前部分患者体内潜伏状态的HHV-6并未能通过所采用的巢式PCR方法检出。预处理期间大剂量放、化疗和移植后免疫抑制剂的应用所造成的免疫抑制为潜伏感染的HHV-6活化提供了机会，62.5%的移植后患者出现HHV-6血症，这充分证明HHV-6活化常见于HSCT后患者。移植后CMV抗原血症的发生率也高达65.3%，两种疱疹病毒感染在HSCT后都普遍存在。通过分析移植前供、受者CMV血清学状态与移植后病毒血症的关系，证实供、受者一方或双方CMV血清学阳性的移植后患者是CMV活化的高危人群，与结论一致［12］。本研究无供者和受者移植前HHV-6血清学资料，检出的HHV-6基因分型以B型为主，与文献报道一致［5］。HSCT后首次检出HHV-6的时间显著早于CMV，且CMV再活化多见于HHV-6血症阳性患者，因此HHV-6与CMV再活化之间是否存在相互作用的问题值得关注。这一问题首先在国外实体器官移植提出［9,13,14］。
Lautenschlager等［14，15］先后采用监测抗原血症和定量PCR检测病毒DNA等方法在肝移植患者中发现CMV和HHV-6血症的相关性。Razonable等［9］在一组包括肝、肾和心脏移植的实体器官移植患者中也发现CMV感染患者同时有HHV-6B型和/或HHV-7感染共存。在HSCT患者人群中，Gentile等［16］在一组骨髓移植患者中发现HHV-6 DNA血症与CMV抗原血症存在相关性。国内在HSCT和实体器官移植方面均未见相关报道。移植后疱疹病毒的活化与移植后免疫抑制状态有关。由于移植后HHV-6再活化发生较CMV早，且其对免疫细胞特别是CD4＋T淋巴细胞具有较强的亲嗜性［3］，被称为免疫抑制性病毒，因此推测HHV-6可能通过对免疫细胞的直接和间接作用进一步影响免疫功能，为CMV活化创造更有利的条件。尽管HHV-6影响免疫功能的机制还未被阐明，但是一些研究已经提供了HHV-6影响免疫功能的证据。首先，HHV-6感染直接影响免疫细胞功能，由此产生的细胞病可直接破坏CD4+T淋巴细胞，改变T细胞表面CD3分子的表达，从而直接影响T细胞活化第一信号的产生［17］。树突状细胞（DC）是启动细胞和体液免疫应答的重要抗原呈递细胞，多项研究发现HHV-6严重损伤DC的抗原呈递功能［18］。另外，HHV-6还可以通过影响细胞因子的产生发挥免疫调节作用。体外研究中证实，HHV-6感染可以抑制T细胞合成IL-2［19］，诱导产生TNF-α和IL-1β［20］，从而诱导T细胞的免疫失能（anergy），严重损伤机体的免疫功能。而体外和体内研究均发现，移植后高水平的TNF-α是引发CMV感染的危险因素［21,22］。由此可见，HHV-6可以通过对免疫细胞的直接和间接作用损伤免疫功能，为CMV再活化创造条件，还可能通过分泌的细胞因子如TNF-α在CMV活化中发挥作用。本实验患者的疱疹病毒感染相关疾病中，间质性肺炎和胃肠炎发生率较低，无法进行统计学分析，HC发生率相对较高且多发生于HHV-6感染或HHV-6与CMV共感染患者。临床上HC的发生往往考虑到腺病毒、CMV感染因素，另外BK病毒感染也是造成移植后HC的重要病因，由于本研究缺乏尿液HHV-6病毒感染的资料，是否HHV-6参与发病过程有待于进一步证实。但有文献报道HHV-6可以在肾脏潜伏，引起感染［23］，结合HHV-6对多种细胞的广泛亲嗜性，HHV-6与HC的相关性值得关注。目前已经有文献报道HHV-6感染与移植后间质性肺炎［7］的发生相关，也有研究在移植后腹泻患者的肠组织内发现HHV-6［24］。深入了解HHV-6与上述疱疹病毒感染相关疾病的关系，对于指导临床治疗和改善患者的预后有重要意义。本研究中所有患者在预处理期间均静脉应用GCV，移植后长期应用ACV预防病毒感染，但移植后HHV-6和CMV的高检出率提示预处理期间静脉应用GCV和移植后口服ACV不能完全预防HHV-6和CMV病毒血症的发生。出现CMV抗原血症时及时予以早期干预治疗是防治疱疹病毒疾病的关键［25］。临床上因CMV感染接受抗病毒治疗的HHV-6 DNA血症患者中，大部分对静脉注射GCV或PFA敏感，提示GCV和PFA有抗HHV-6活性。但是对于GCV和PFA治疗HHV-6感染的确切疗效还需要病例对照研究进一步明确。总之，HHV-6感染或HHV-6与CMV共感染状态在HSCT后患者普遍存在。HHV-6感染与CMV感染显著相关，提示二者可能存在相互作用。HHV-6与CMV感染之间的确切关系和临床意义以及HHV-6与疱疹病毒感染相关疾病的关系有待于进一步研究。
致谢：感谢军事医学院微生物与流行病研究所病原微生物研究室周育森、陈万容主任和丁美老师在阳性质粒标准品构建中的支持。感谢北京道培刘东平老师在CMV抗原血症检测方面的帮助。感谢北京大学人民医院和北京道培医院骨髓移植病房黄晓军、刘开彦、吴彤主任；刘代红、韩伟、许兰平、陈欢主治医师以及其他医护人员在收集标本和提供病例资料方面的协助。
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